Fosfoenolpiruvato carboxilase - Phosphoenolpyruvate carboxylase
| Fosfoenolpiruvato carboxilase | |||||||||
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 a estrutura de subunidade única de Fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilase (gerada por PyMOL)]
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| Identificadores | |||||||||
| EC nº | 4.1.1.31 | ||||||||
| CAS no. | 9067-77-0 | ||||||||
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| IntEnz | Vista IntEnz | ||||||||
| BRENDA | Entrada BRENDA | ||||||||
| ExPASy | NiceZyme view | ||||||||
| KEGG | Entrada KEGG | ||||||||
| MetaCyc | via metabólica | ||||||||
| PRIAM | perfil | ||||||||
| Estruturas PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| Ontologia Genética | AmiGO / QuickGO | ||||||||
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| Fosfoenolpiruvato carboxilase | |||||||||||
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| Identificadores | |||||||||||
| Símbolo | PEPcase | ||||||||||
| Pfam | PF00311 | ||||||||||
| InterPro | IPR001449 | ||||||||||
| PRÓSITO | PDOC00330 | ||||||||||
| SCOP2 | 1fiy / SCOPe / SUPFAM | ||||||||||
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A fosfoenolpiruvato carboxilase (também conhecida como PEP carboxilase , PEPCase ou PEPC ; EC 4.1.1.31 , PDB ID: 3ZGE) é uma enzima da família das carboxiliases encontrada em plantas e algumas bactérias que catalisa a adição de bicarbonato (HCO 3 - ) em fosfoenolpiruvato (PEP) para formar o composto de quatro carbonos oxaloacetato e fosfato inorgânico :
- PEP + HCO 3 - → oxaloacetato + Pi
Esta reação é usada para a fixação de carbono em organismos CAM (metabolismo do ácido crassuláceo) e C 4 , bem como para regular o fluxo através do ciclo do ácido cítrico (também conhecido como ciclo de Krebs ou TCA ) em bactérias e plantas. A estrutura da enzima e seu mecanismo catalítico irreversível de duas etapas foram bem estudados. PEP carboxilase é altamente regulada, tanto por fosforilação e allostery .
Estrutura da enzima
A enzima PEP carboxilase está presente em plantas e alguns tipos de bactérias, mas não em fungos ou animais (incluindo humanos). Os genes variam entre os organismos, mas são estritamente conservados em torno dos sítios ativos e alostéricos discutidos nas seções de mecanismo e regulação. A estrutura terciária da enzima também é conservada.
A estrutura cristalina da PEP carboxilase em vários organismos, incluindo Zea mays (milho) e Escherichia coli foi determinada. A enzima global existe como um dímero de dímeros: duas subunidades idênticas interagem intimamente para formar um dímero através de pontes de sal entre arginina (R438 - posições exatas podem variar dependendo da origem do gene) e resíduos de ácido glutâmico (E433). Este dímero se reúne (mais livremente) com outro de seu tipo para formar o complexo de quatro subunidades. As subunidades monoméricas são compostas principalmente por hélices alfa (65%) e têm massa de 106kDa cada. O comprimento da sequência é de cerca de 966 aminoácidos .
O sítio ativo da enzima não está completamente caracterizado. Inclui um ácido aspártico conservado (D564) e um resíduo de ácido glutâmico (E566) que se ligam de forma não covalente a um íon cofator de metal divalente por meio dos grupos funcionais de ácido carboxílico . Este íon metálico pode ser magnésio , manganês ou cobalto dependendo do organismo, e sua função é coordenar a molécula de fosfoenolpiruvato e também os intermediários da reação. A histidina é acreditado resíduo (H138) no local activo para facilitar a transferência de protões durante o mecanismo catalítico.
Mecanismo de enzima
O mecanismo da PEP carboxilase foi bem estudado. O mecanismo enzimático de formação de oxaloacetato é muito exotérmico e, portanto, irreversível; a mudança biológica de energia livre de Gibbs (△ G ° ') é -30kJmol −1 . Os substratos e o cofator ligam-se na seguinte ordem: cofator metálico (Co 2+ , Mg 2+ ou Mn 2+ ), PEP, bicarbonato (HCO 3 - ). O mecanismo prossegue em duas etapas principais, conforme descrito abaixo e mostrado na figura 2:
- O bicarbonato atua como um nucleófilo para atacar o grupo fosfato na PEP. Isso resulta na divisão de PEP em um carboxifosfato e a forma enolato (muito reativa) do piruvato .
- A transferência de prótons ocorre no carboxifosfato. Isso é provavelmente modulado por um resíduo de histidina (H138) que primeiro desprotona o lado carboxi e, em seguida, como um ácido, protona a parte fosfato. O carboxifosfato então se decompõe exotermicamente em dióxido de carbono e fosfato inorgânico, neste ponto tornando esta reação irreversível. Finalmente, após a decomposição, o dióxido de carbono é atacado pelo enolato para formar oxaloacetato.
O cofator de metal é necessário para coordenar os intermediários enolato e dióxido de carbono; a molécula de CO 2 é perdida apenas 3% do tempo. O sítio ativo é hidrofóbico para excluir água , uma vez que o intermediário carboxifosfato é suscetível à hidrólise .
Função
Os três papéis mais importantes que a PEP carboxilase desempenha no metabolismo de plantas e bactérias estão no ciclo C 4 , no ciclo CAM e no fluxo de biossíntese do ciclo do ácido cítrico .
O principal mecanismo de assimilação do dióxido de carbono nas plantas é através da enzima ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase / oxigenase (também conhecida como RuBisCO ), que adiciona CO 2 à ribulose-1,5-bifosfato (um açúcar de 5 carbonos), para formar duas moléculas de 3-fosfoglicerato (açúcares de carbono 2x3). No entanto, em temperaturas mais altas e menores concentrações de CO 2 , RuBisCO adiciona oxigênio em vez de dióxido de carbono, para formar o glicolato de produto inutilizável em um processo chamado fotorrespiração . Para evitar esse desperdício de processo, as fábricas aumentam a concentração local de CO 2 em um processo denominado ciclo C 4 . PEP carboxilase desempenha o papel principal de ligação de CO 2 na forma de bicarbonato com PEP para criar oxaloacetato no tecido mesofílico . Este é então convertido de volta em piruvato (por meio de um intermediário malato ), para liberar o CO 2 na camada mais profunda das células da bainha do feixe para fixação de carbono por RuBisCO e o ciclo de Calvin . O piruvato é convertido de volta em PEP nas células do mesófilo e o ciclo começa novamente, bombeando ativamente o CO 2 .
O segundo significado biológico importante e muito semelhante da PEP carboxilase está no ciclo CAM . Este ciclo é comum em organismos que vivem em habitats áridos. As plantas não podem se dar ao luxo de abrir estômatos durante o dia para absorver CO 2 , pois perderiam muita água pela transpiração . Em vez disso, os estômatos abrem à noite, quando a evaporação da água é mínima, e absorvem CO 2 fixando-se com PEP para formar oxaloacetato através da PEP carboxilase. O oxaloacetato é convertido em malato pela malato desidrogenase e armazenado para uso durante o dia, quando a reação dependente da luz gera energia (principalmente na forma de ATP ) e equivalentes redutores como o NADPH para executar o ciclo de Calvin .
Terceiro, a PEP carboxilase é significativa nas vias metabólicas não fotossintéticas. A Figura 3 mostra esse fluxo metabólico (e sua regulação). Semelhante à piruvato carboxilase , a PEP carboxilase repõe o oxaloacetato no ciclo do ácido cítrico. No final da glicólise , o PEP é convertido em piruvato , que é convertido em acetil-coenzima-A ( acetil-CoA ), que entra no ciclo do ácido cítrico reagindo com oxaloacetato para formar citrato . Para aumentar o fluxo ao longo do ciclo, parte do PEP é convertido em oxaloacetato pela PEP carboxilase. Uma vez que os intermediários do ciclo do ácido cítrico fornecem um centro para o metabolismo, aumentar o fluxo é importante para a biossíntese de muitas moléculas, como, por exemplo, aminoácidos .
Regulamento
A PEP carboxilase está principalmente sujeita a dois níveis de regulação: fosforilação e alosteria . A Figura 3 mostra um esquema do mecanismo regulatório.
A fosforilação pela fosfoenolpiruvato carboxilase quinase ativa a enzima, enquanto a fosfoenolpiruvato carboxilase fosfatase a desativa. Tanto a quinase quanto o fosfato são regulados pela transcrição . Acredita-se ainda que o malato atua como um inibidor de feedback dos níveis de expressão da quinase e como um ativador da expressão da fosfatase (transcrição). Uma vez que o oxaloacetato é convertido em malato nos organismos CAM e C 4 , altas concentrações de malato ativam a expressão da fosfatase - a fosfatase subsequentemente desfosforila e, assim, desativa a PEP carboxilase, levando a nenhum acúmulo adicional de oxaloacetato e, portanto, nenhuma conversão adicional de oxaloacetato em malato. Conseqüentemente, a produção de malato é regulada para baixo.
Os principais inibidores alostéricos da PEP carboxilase são os ácidos carboxílicos malato (fraco) e aspartato (forte). Como o malato é formado na próxima etapa dos ciclos CAM e C 4 após a PEP carboxilase catalisar a condensação de CO 2 e PEP em oxaloacetato, isso funciona como uma via de inibição por feedback. O oxaloacetato e o aspartato são facilmente interconvertíveis por meio de um mecanismo de transaminase ; assim, altas concentrações de aspartato também são uma via de inibição por feedback da PEP carboxilase.
Os principais ativadores alostéricos da PEP carboxilase são acetil-CoA e frutose-1,6-bifosfato (F-1,6-BP). Ambas as moléculas são indicadores de níveis aumentados de glicólise e, portanto, efetores de feed-forward positivos de PEP carboxilase. Eles sinalizam a necessidade de produzir oxaloacetato para permitir mais fluxo através do ciclo do ácido cítrico . Além disso, o aumento da glicólise significa que um suprimento maior de PEP está disponível e, portanto, mais capacidade de armazenamento para ligar o CO 2 no transporte para o ciclo de Calvin . É também digno de nota que o efetor negativo aspartato compete com o efetor positivo acetil-CoA , sugerindo que eles compartilham um sítio de ligação alostérico.
Estudos demonstraram que equivalentes de energia como AMP , ADP e ATP não têm efeito significativo na PEP carboxilase.
As magnitudes dos efeitos alostéricos dessas diferentes moléculas na atividade da PEP carboxilase dependem de organismos individuais.
