Aequorin - Aequorin

Aequorin 1
Aequorin 1EJ3.png
Diagrama de fita de equorina de PDB 1ej3 com grupo protético coelenterazina em azul
Identificadores
Organismo Aequorea victoria (medusa)
Símbolo N / D
UniProt P07164
Outros dados
Número CE 1.13.12.5

A equorina é uma fotoproteína ativada por cálcio isolada do hidrozoário Aequorea victoria . Sua bioluminescência foi estudada décadas antes de a proteína ser isolada do animal por Osamu Shimomura em 1962. No animal, a proteína ocorre junto com a proteína fluorescente verde para produzir luz verde por transferência ressonante de energia , enquanto a aequorina por si mesma gera luz azul.

As discussões sobre o "DNA de água-viva" que pode fazer animais "brilhantes" geralmente se referem a animais transgênicos que expressam a proteína fluorescente verde, não a aequorina, embora ambas derivem originalmente do mesmo animal.

Apoaequorin, a porção proteica da aequorin, é um ingrediente do suplemento dietético Prevagen. A Comissão Federal de Comércio dos Estados Unidos (FTC) acusou o fabricante de propaganda enganosa por suas alegações de melhoria de memória.

Descoberta

O trabalho com a aequorin começou com E. Newton Harvey em 1921. Embora Harvey não tenha conseguido demonstrar uma reação luciferase - luciferina clássica , ele mostrou que a água pode produzir luz a partir de fotócitos secos e que a luz pode ser produzida mesmo na ausência de oxigênio. Mais tarde, Osamu Shimomura começou a trabalhar na bioluminescência de Aequorea em 1961. Isso envolveu a colheita tediosa de dezenas de milhares de águas-vivas nas docas de Friday Harbor, Washington . Foi determinado que a luz poderia ser produzida a partir de extratos com água do mar e, mais especificamente, com cálcio . Também foi notado durante a extração que o animal cria luz verde devido à presença da proteína fluorescente verde , que muda a luz azul nativa da aequorina para verde.

Embora o foco principal de seu trabalho fosse a bioluminescência, Shimomura e dois outros, Martin Chalfie e Roger Tsien , receberam o Prêmio Nobel em 2008 por seu trabalho sobre proteínas fluorescentes verdes .

Estrutura

A equorina é uma holoproteína composta por duas unidades distintas, a apoproteína chamada apoaequorina , que tem peso molecular aproximado de 21 kDa , e o grupo protético da coelenterazina , a luciferina. Ou seja, a apoaequorina é a enzima produzida nos fotócitos do animal, e a coelenterazina é o substrato cuja oxidação a enzima catalisa. Quando a coelenterazina é ligada, ela é chamada de equorina. Notavelmente, a proteína contém três motivos de mão EF que funcionam como sítios de ligação para íons Ca 2+ . A proteína é um membro da superfamília das proteínas de ligação ao cálcio, das quais existem cerca de 66 subfamílias.

A estrutura cristalina revelou que a equorina liga a coelenterazina e o oxigênio na forma de um peróxido , coelenterazina-2-hidroperóxido. O sítio de ligação para os primeiros dois átomos de cálcio mostra uma afinidade 20 vezes maior para o cálcio do que o terceiro sítio. No entanto, afirmações anteriores de que apenas duas mãos EF ligam o cálcio foram questionadas quando estruturas posteriores indicaram que todos os três locais podem de fato ligar o cálcio. Assim, estudos de titulação mostram que todos os três locais de ligação do cálcio estão ativos, mas apenas dois íons são necessários para desencadear a reação enzimática.

Outros estudos mostraram a presença de uma ligação interna de cisteína que mantém a estrutura da aequorina. Isso também explicou a necessidade de um reagente tiol como o beta mercaptoetanol na regeneração da proteína, uma vez que tais reagentes enfraquecem as ligações sulfidrila entre os resíduos de cisteína , acelerando a regeneração da aequorina.

A caracterização química da aequorina indica que a proteína é um pouco resistente a tratamentos agressivos. Aequorin é resistente ao calor. Mantida a 95 ° C por 2 minutos, a proteína perdeu apenas 25% da atividade. Os desnaturantes como a ureia 6 M ou o cloridrato de guanidina 4 M não destruíram a proteína.

Genética

Aequorina é presumivelmente codificada no genoma de Aequorea. Pelo menos quatro cópias do gene foram recuperadas como cDNA do animal. Como o genoma não foi sequenciado, não está claro se as variantes de cDNA podem ser responsáveis ​​por todas as isoformas da proteína.

Mecanismo de ação

Os primeiros estudos da bioluminescência de Aequorea por E. Newton Harvey observaram que a bioluminescência aparece como um anel ao redor do sino e ocorre mesmo na ausência de ar. Isso foi notável porque a maioria das reações de bioluminescência requer oxigênio e levou à ideia de que os animais de alguma forma armazenam oxigênio. Mais tarde, foi descoberto que a apoproteína pode se ligar de forma estável à coelenterazina-2-hidroperóxido e que o oxigênio é necessário para a regeneração desta forma ativa de aequorina. Porém, na presença de íons cálcio , a proteína sofre uma mudança conformacional e converte seu grupo protético, coelenterazina-2-hidroperóxido, em coelenteramida excitada e CO 2 . Conforme a coelenteramida excitada relaxa para o estado fundamental, uma luz azul ( comprimento de onda de 465 nm) é emitida. Antes da coelenteramida ser trocada, toda a proteína ainda é azul fluorescente. Por causa da conexão entre bioluminescência e fluorescência , esta propriedade foi importante na descoberta da luciferina coelenterazina .

Formulários

Uma vez que a luz emitida pode ser facilmente detectada com um luminômetro , a aequorin tornou-se uma ferramenta útil em biologia molecular para a medição dos níveis intracelulares de Ca 2+ . O sucesso inicial da purificação da aequorina levou aos primeiros experimentos envolvendo a injeção da proteína nos tecidos de animais vivos para visualizar a liberação fisiológica de cálcio nas fibras musculares de uma craca. Desde então, a proteína tem sido amplamente utilizada em muitos sistemas biológicos modelo , incluindo peixe-zebra , ratos , camundongos e células em cultura .

As células cultivadas que expressam o gene da aequorina podem efetivamente sintetizar apoaequorina; no entanto, a expressão recombinante produz apenas a apoproteína . Portanto, é necessário adicionar coelenterazina no meio de cultura das células para obter uma proteína funcional e, assim, usar sua emissão de luz azul para medir a concentração de Ca 2+ . A coelenterazina é uma molécula hidrofóbica e, portanto, é facilmente absorvida pelas paredes das células vegetais e fúngicas , bem como pela membrana plasmática de eucariotos superiores, tornando a aequorina adequada como repórter de Ca 2+ em plantas, fungos e células de mamíferos.

Aequorin tem uma série de vantagens sobre outros indicadores de Ca 2+ . Como a proteína é grande, ela tem uma baixa taxa de vazamento das células em comparação com os corantes lipofílicos , como DII . Ele não possui fenômenos de compartimentação ou sequestro intracelular, como é freqüentemente visto em corantes sensíveis à voltagem , e não interrompe as funções celulares ou o desenvolvimento embrionário. Além disso, a luz emitida pela oxidação da coelenterazina não depende de nenhuma excitação óptica, de forma que os problemas com a autofluorescência são eliminados. A principal limitação da aequorina é que o grupo protético da coelenterazina é irreversivelmente consumido para produzir luz e requer a adição contínua de coelenterazina na mídia. Tais questões levaram ao desenvolvimento de outros sensores de cálcio codificados geneticamente, incluindo o sensor cameleon baseado em calmodulina , desenvolvido por Roger Tsien e o sensor baseado em troponina , TN-XXL , desenvolvido por Oliver Griesbeck.

Desafios de marketing e jurídicos

Apoaequorin é um ingrediente do "Prevagen", que é comercializado pela Quincy Bioscience como um suplemento de memória. Em 2017, a Comissão Federal de Comércio dos Estados Unidos (FTC) acusou o fabricante de anunciar falsamente que o produto melhora a memória, fornece benefícios cognitivos e é "clinicamente demonstrado" que funciona. De acordo com a FTC, "os comerciantes do Prevagen se alimentavam do medo dos consumidores mais velhos de perda de memória relacionada à idade ". Quincy disse que lutaria contra as acusações.

Antes do processo, um ensaio clínico conduzido por pesquisadores empregados pela Quincy Bioscience "não encontrou nenhum benefício geral em comparação com um placebo para seus desfechos primários envolvendo memória e cognição", enquanto a publicidade da empresa citou erroneamente algumas análises contestadas de subgrupos que mostraram ligeiras melhorias.

O processo ( Spath et al v. Quincy Bioscience Holding Company, Inc. et al. , Caso nº 18-cv-12416, D. NJ.) Foi indeferido no tribunal distrital, mas um recurso para anular a decisão foi interposto . O processo foi consolidado com outro contra a Quincy Pharmaceuticals, Vanderwerff v. Quincy Bioscience (Processo nº 17-cv-784, D. NJ), que foi o caso principal.

Em 21 de fevereiro de 2019, o Tribunal de Apelações dos Estados Unidos para o Segundo Circuito decidiu que a FTC e o estado de Nova York poderiam prosseguir com o processo contra a Quincy Bioscience por suas alegações de que Prevagen pode melhorar a memória. A ordem veio menos de duas semanas depois que as partes discutiram o caso perante um painel de três juízes do circuito, onde os advogados da empresa admitiram que não "contestaram que, se você olhar para todas as 211 pessoas que concluíram o estudo, não houve significância estatística diferença". O tribunal rejeitou vigorosamente as alegações dos advogados da empresa de que a FTC prosseguiu sua ação por motivos políticos.

Em 23 de março de 2020, um juiz federal do Tribunal Distrital dos Estados Unidos para o Distrito Sul da Flórida apresentou um relatório e recomendações que certificam uma ação coletiva em todo o país para a classe de consumidores que compraram Prevagen nos últimos quatro anos. O julgamento do caso está marcado para outubro de 2020.

A Dra. Harriet Hall , escrevendo para a Science-Based Medicine , observa que o estudo patrocinado por Quincy (conhecido como "Madison Memory Study") foi negativo, mas que a empresa utilizou p-hacking para encontrar resultados favoráveis. Ela observa que os estudos de segurança citados são todos estudos em ratos e sua alegação de que a apoaequorina atravessa a barreira hematoencefálica é baseada exclusivamente em um estudo em cães. A American Pharmacists Association avisa que Apoaequorin "é improvável que seja absorvido em um grau significativo; em vez disso, degrada-se em aminoácidos".

Referências

links externos