Criomicroscopia eletrônica de transmissão - Transmission electron cryomicroscopy

Imagem CryoTEM de GroEL suspensa em gelo amorfo em Ampliação de 50 000 ×

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Estrutura da álcool oxidase de Pichia pastoris por CryoTEM

A criomicroscopia eletrônica de transmissão ( CryoTEM ), comumente conhecida como crio-EM , é uma forma de microscopia eletrônica criogênica , mais especificamente um tipo de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), onde a amostra é estudada em temperaturas criogênicas (geralmente temperaturas de nitrogênio líquido ). O Cryo-EM está ganhando popularidade na biologia estrutural .

A utilidade da criomicroscopia de transmissão de elétrons decorre do fato de permitir a observação de espécimes que não foram corados ou fixados de nenhuma forma, mostrando-os em seu ambiente nativo. Isso contrasta com a cristalografia de raios X , que requer a cristalização da amostra, o que pode ser difícil, e sua colocação em ambientes não fisiológicos, o que pode ocasionalmente levar a alterações conformacionais funcionalmente irrelevantes.

Avanços na tecnologia de detector de elétrons , particularmente DDE (Direct Electron Detectors), bem como algoritmos de imagem de software mais poderosos, permitiram a determinação de estruturas macromoleculares em resolução quase atômica. As macromoléculas com imagens incluem vírus , ribossomos , mitocôndrias , canais iônicos e complexos enzimáticos . A partir de 2018, o crio-EM pode ser aplicado a estruturas tão pequenas quanto a hemoglobina (64 kDa ) e com resoluções de até 1,8 Å . Em 2019, as estruturas crio-EM representavam 2,5% das estruturas depositadas no Protein Data Bank , e esse número continua crescendo. Uma aplicação de crio-EM é a tomografia crioeletrônica (crio-ET), onde uma reconstrução 3D da amostra é criada a partir de imagens 2D inclinadas.

Desenvolvimento

A base lógica original do CryoTEM era como um meio de combater os danos da radiação em espécimes biológicos. A quantidade de radiação necessária para coletar uma imagem de um espécime no microscópio eletrônico é alta o suficiente para ser uma fonte potencial de danos ao espécime para estruturas delicadas. Além disso, o alto vácuo exigido na coluna de um microscópio eletrônico torna o ambiente para a amostra bastante hostil.

O problema do vácuo foi parcialmente resolvido pela introdução de colorações negativas, mas mesmo com colorações negativas as amostras biológicas estão sujeitas a colapso estrutural após a desidratação da amostra. Incorporar as amostras no gelo abaixo da temperatura de sublimação era uma possibilidade que foi contemplada no início, mas a água tende a se organizar em uma rede cristalina de densidade mais baixa ao congelar e isso pode destruir a estrutura de qualquer coisa que esteja embutida nela.

No início dos anos 1980, vários grupos que estudavam a física do estado sólido estavam tentando produzir gelo vítreo por diferentes meios, como congelamento de alta pressão ou congelamento instantâneo. Em um artigo seminal em 1984, o grupo liderado por Jacques Dubochet no Laboratório Europeu de Biologia Molecular mostrou imagens de adenovírus embutidos em uma camada vitrificada de água. Este artigo é geralmente considerado como uma marca da origem do Cryo-EM, e a técnica foi desenvolvida a ponto de se tornar rotina em vários laboratórios em todo o mundo.

A energia dos elétrons usados ​​para a geração de imagens (80–300 kV) é alta o suficiente para que as ligações covalentes possam ser quebradas. Quando as amostras de imagem são vulneráveis ​​a danos por radiação, é necessário limitar a exposição do elétron usada para adquirir a imagem. Essas baixas exposições exigem que as imagens de milhares ou mesmo milhões de moléculas congeladas idênticas sejam selecionadas, alinhadas e calculadas para obter mapas de alta resolução, usando software especializado. Uma melhoria significativa nas características estruturais foi alcançada em 2012 com a introdução de detectores diretos de elétrons e melhores algoritmos computacionais.

Em 2015, Bridget Carragher e colegas do Scripps National Resource for Automated Molecular Microscopy usaram técnicas que ela e Clint Potter desenvolveram para determinar a primeira estrutura crio-EM com uma resolução mais fina que 3 Å, elevando assim o CryoTEM como uma ferramenta comparável e potencialmente superior às técnicas tradicionais de cristalografia de raios-X. Desde então, resoluções mais altas foram alcançadas, incluindo uma estrutura de 2,2 Å da enzima bacteriana β-galactosidase em 2015 e uma estrutura de 1,8 Å de glutamato desidrogenase em 2016. O crio-EM também foi usado para determinar a estrutura de vários vírus, incluindo o Zika vírus e tem sido aplicado a grandes complexos, como o spliceossomo . Em 2017, o Prêmio Nobel de Química foi concedido em conjunto a Jacques Dubochet , Joachim Frank e Richard Henderson , "pelo desenvolvimento da microscopia crioeletrônica para a determinação da estrutura de alta resolução de biomoléculas em solução".

Espécimes biológicos

Filme fino

O material biológico é espalhado em uma grade de microscopia eletrônica e é preservado em um estado hidratado congelado por congelamento rápido, geralmente em etano líquido próximo à temperatura do nitrogênio líquido . Ao manter as amostras na temperatura do nitrogênio líquido ou mais fria, elas podem ser introduzidas no alto vácuo da coluna do microscópio eletrônico . A maioria dos espécimes biológicos é extremamente radiossensível , portanto, eles devem ser fotografados com técnicas de baixa dose (de forma útil, a baixa temperatura da criomicroscopia eletrônica de transmissão fornece um fator de proteção adicional contra danos por radiação).

Consequentemente, as imagens são extremamente ruidosas . Para alguns sistemas biológicos, é possível calcular a média de imagens para aumentar a relação sinal-ruído e recuperar informações de alta resolução sobre o espécime usando a técnica conhecida como análise de partícula única . Esta abordagem em geral requer que as coisas que estão sendo calculadas sejam idênticas, embora alguma heterogeneidade conformacional limitada possa agora ser estudada (por exemplo, ribossomo ). Reconstruções tridimensionais de imagens CryoTEM de complexos de proteínas e vírus foram resolvidas para resolução sub-nanométrica ou quase atômica, permitindo novos insights sobre a estrutura e biologia desses grandes conjuntos.

A análise de arranjos ordenados de proteínas, como cristais 2-D de proteínas transmembrana ou arranjos helicoidais de proteínas, também permite um tipo de média que pode fornecer informações de alta resolução sobre o espécime. Essa técnica é chamada de cristalografia de elétrons .

Seções vítreas

O método de filme fino é limitado a amostras finas (normalmente <500 nm) porque os elétrons não podem cruzar amostras mais espessas sem vários eventos de espalhamento. Amostras mais espessas podem ser vitrificadas por congelamento por mergulho ( criofixação ) em etano (até dezenas de μm de espessura) ou mais comumente por congelamento de alta pressão (até centenas de μm). Eles podem então ser cortados em seções finas (40 a 200 nm de espessura) com uma faca de diamante em um crioltramicrótomo a temperaturas inferiores a −135 ° C (temperatura de desvitrificação). As seções são coletadas em uma grade de microscópio eletrônico e são visualizadas da mesma maneira que a amostra vitrificada em filme fino. Essa técnica é chamada de cromicroscopia eletrônica de transmissão de seções vítreas (CEMOVIS) ou criomicroscopia eletrônica de transmissão de seções hidratadas congeladas.

Espécimes de material

Além de permitir a obtenção de imagens de amostras biológicas vitrificadas, o CryoTEM também pode ser usado para obter imagens de espécimes de materiais que são muito voláteis no vácuo para serem capturados em microscopia eletrônica padrão à temperatura ambiente. Por exemplo, seções vitrificadas de interfaces líquido-sólido podem ser extraídas para análise por CryoTEM, e enxofre, que é propenso a sublimação no vácuo de microscópios eletrônicos, pode ser estabilizado e visualizado em CryoTEM.

Técnicas

Uma variedade de técnicas pode ser usada no CryoTEM. As técnicas populares incluem:

1. Cristalografia de elétrons
   1. Análise de cristais bidimensionais
   2. Análise de filamentos helicoidais ou tubos
   3. Difração de elétrons microcristais (MicroED)
2. Análise de partícula única (SPA)
   1. CryoTEM resolvido com tempo
3. Criotomografia de elétrons (cryoET)

Veja também

• Microscopia eletrônica de varredura criogênica
• Banco de Dados EM
• Resolução (densidade de elétrons)
• Análise de partícula única

Referências

Leitura adicional

• Frank J (2006). Microscopia Eletrônica Tridimensional de Conjuntos Macromoleculares . Nova York: Oxford University Press . ISBN   0-19-518218-9 .
• van Heel M, Gowen B, Matadeen R, Orlova EV, Finn R, Pape T, Cohen D, Stark H, Schmidt R, Schatz M, Patwardhan A (novembro de 2000). "Crio-microscopia eletrônica de partícula única: em direção à resolução atômica" . Revisões trimestrais de Biofísica . 33 (4): 307–69. doi : 10.1017 / s0033583500003644 . PMID   11233408 .

links externos

• "EM for Dummies" . Recuperado em 9 de junho de 2006 .
• A Estrutura Fina de um Vírus Congelado - A criomicroscopia sofisticada de elétrons de partícula única revela detalhes sem precedentes na capa protéica de um vírus, Technology Review , 19 de março de 2008
• Introdução ao Cryo-EM - curso online da Caltech, Professor Grant Jensen
• Banco de Dados EM
• Tendências EMstats e distribuições de mapas em EMDB, por exemplo, tendências de resolução