Beta-galactosidase - Beta-galactosidase

β-galactosidase
β-galactosidase de Penicillum sp.
Identificadores
EC nº	3.2.1.23
CAS no.	9031-11-2
Bancos de dados
IntEnz	Vista IntEnz
BRENDA	Entrada BRENDA
ExPASy	NiceZyme view
KEGG	Entrada KEGG
MetaCyc	via metabólica
PRIAM	perfil
Estruturas PDB	RCSB PDB PDBe PDBsum
Ontologia Genética	AmiGO / QuickGO
Procurar PMC artigos PubMed artigos NCBI proteínas

A β-galactosidase , também chamada de lactase , beta-gal ou β-gal , é uma família de enzimas glicosídeo hidrolase que catalisa a hidrólise de β-galactosídeos em monossacarídeos por meio da quebra de uma ligação glicosídica . Os β-galactosídeos incluem carboidratos contendo galactose onde a ligação glicosídica fica acima da molécula de galactose. Os substratos de diferentes β-galactosidases incluem gangliósido GM1, lactosilceramidas, lactose e várias glicoproteínas .

Nomenclatura

A Enzyme Commission é responsável por criar um sistema de classificação de enzimas baseado em números. O primeiro número descreve a qual classe a enzima pertence, o segundo número da subclasse de referência, o terceiro valor especifica a natureza do substrato e o quarto número é um número de série atribuído às enzimas dentro de uma subclasse. O número EC ( Enzyme Commission) de β-galactosidase é 3.2.1.23  β-galactosidase pertence à classe 3, que se refere às hidrolases . β-gal pertence a uma subclasse de glicosilases com uma natureza de substrato de oxigênio.

Função

A β-galactosidase é uma exoglicosidase que hidrolisa a ligação β- glicosídica formada entre uma galactose e sua porção orgânica. Também pode clivar fucosídeos e arabinosídeos, mas com eficiência muito menor. É uma enzima essencial do corpo humano. Deficiências na proteína pode resultar em galactosialidose ou síndrome de Morquio B . Em E. coli , o gene lacZ é o gene estrutural para β-galactosidase; que está presente como parte do operon lac do sistema induzível, que é ativado na presença de lactose quando o nível de glicose está baixo. A síntese de β-galactosidase para quando os níveis de glicose são suficientes.

A beta-galactosidase possui muitos homólogos baseados em sequências semelhantes. Alguns são beta-galactosidase (EBG), beta-glucosidase , 6-fosfo-beta-galactosidase, beta-manosidase e lactase-florizina hidrolase evoluída. Embora possam ser estruturalmente semelhantes, todos têm funções diferentes. Beta-gal é inibido por L-ribose , inibidor não competitivo de iodo e inibidores competitivos 2-feniletil 1-tio-beta-D-galactopiranosídeo (PETG), D-galactonolactona, isopropiltio-beta-D-galactosídeo (IPTG) e galactose.

A β-galactosidase é importante para os organismos, pois é um fornecedor chave na produção de energia e uma fonte de carbonos através da quebra da lactose em galactose e glicose. Também é importante para a comunidade intolerante à lactose , pois é responsável pela produção de leite sem lactose e outros laticínios. Muitos humanos adultos não possuem a enzima lactase , que tem a mesma função da beta-gal, portanto não são capazes de digerir adequadamente os laticínios. A beta-galactose é usada em laticínios como iogurte, creme de leite e alguns queijos que são tratados com a enzima para quebrar qualquer lactose antes do consumo humano. Nos últimos anos, a beta-galactosidase foi pesquisada como um tratamento potencial para a intolerância à lactose por meio da terapia de substituição de genes, onde poderia ser colocada no DNA humano para que os indivíduos pudessem quebrar a lactose por conta própria.

Estrutura

Os 1.023 aminoácidos da β-galactosidase de E. coli foram sequenciados com precisão em 1983, e sua estrutura determinada onze anos depois, em 1994. A proteína é um homotetrâmero de 464 kDa com simetria de 2,2,2 pontos . Cada unidade de β-galactosidase consiste em cinco domínios ; o domínio 1 é um barril β do tipo gelatina , os domínios 2 e 4 são barris semelhantes à fibronectina do tipo III , o domínio 5 é um novo sanduíche β, enquanto o domínio central 3 é um barril do tipo TIM distorcido , sem a quinta hélice com uma distorção na sexta fita.

O terceiro domínio contém o site ativo. O sítio ativo é composto de elementos de duas subunidades do tetrâmero, e a dissociação do tetrâmero em dímeros remove os elementos críticos do sítio ativo. A sequência amino-terminal da β-galactosidase, o α-peptídeo envolvido na α-complementação, participa de uma interface de subunidade. Seus resíduos 22-31 ajudam a estabilizar um feixe de quatro hélices que forma a maior parte dessa interface, e os resíduos 13 e 15 também contribuem para a interface de ativação. Essas características estruturais fornecem uma justificativa para o fenômeno de complementação α, onde a deleção do segmento amino-terminal resulta na formação de um dímero inativo.

Reação

reação de β-galactosidase

A β-galactosidase pode catalisar três reações diferentes nos organismos. Em um, ele pode passar por um processo chamado transgalactosilação para fazer alolactose , criando um ciclo de feedback positivo para a produção de β-gal. A alolactose também pode ser clivada para formar monossacarídeos. Também pode hidrolisar a lactose em galactose e glicose, que irão para a glicólise . O sítio ativo da β-galactosidase catalisa a hidrólise de seu substrato dissacarídeo por meio de ligações "rasas" (sítio não produtivo) e "profundas" (sítio produtivo). Galactosídeos como PETG e IPTG se ligam no sítio raso quando a enzima está em conformação "aberta", enquanto análogos do estado de transição , como L-ribose e D-galactonolactona, se ligam no sítio profundo quando a conformação está "fechada".

A reação enzimática consiste em duas etapas químicas, galactosilação (k ₂ ) e desgalactosilação (k ₃ ). A galactosilação é a primeira etapa química na reação em que Glu461 doa um próton para um oxigênio glicosídico, resultando na ligação covalente da galactose com Glu537. Na segunda etapa, a degalactosilação, a ligação covalente é quebrada quando Glu461 aceita um próton, substituindo a galactose por água. Dois estados de transição ocorrem no local profundo da enzima durante a reação, uma vez após cada etapa. Quando a água participa da reação, forma-se galactose, caso contrário, quando a D-glicose atua como aceptora na segunda etapa, ocorre a transgalactosilação. Foi medido cineticamente que tetrâmeros únicos da proteína catalisam reações a uma taxa de 38.500 ± 900 reações por minuto. Íons de potássio monovalentes (K ⁺ ), bem como íons de magnésio divalentes (Mg ²⁺ ) são necessários para a atividade ótima da enzima. A ligação beta do substrato é clivada por um grupo carboxila terminal na cadeia lateral de um ácido glutâmico .

A imagem à esquerda é um diagrama de fita de beta-galactosidase exibindo a localização de Glu 461, Glu 537 e Gly 794. A imagem à direita é uma versão ampliada mostrando a interação entre os aminoácidos.

Em E. coli , pensava-se que o Glu-461 era o nucleófilo na reação de substituição . No entanto, agora se sabe que o Glu-461 é um catalisador ácido . Em vez disso, Glu-537 é o nucleófilo real, ligando-se a um intermediário galactosil. Em humanos , o nucleófilo da reação de hidrólise é Glu-268. Gly794 é importante para a atividade β-gal. É responsável por colocar a enzima em uma conformação "fechada", ligada por ligante, ou "aberta", agindo como uma "dobradiça" para a alça do local ativo. As diferentes conformações garantem que apenas a ligação preferencial ocorra no sítio ativo. Na presença de um substrato lento, a atividade de Gly794 aumentou, bem como um aumento na galactosilação e diminuição na degalactosilação.

Formulários

O ensaio da β-galactosidase é usado com frequência em genética , biologia molecular e outras ciências biológicas . Uma enzima ativa pode ser detectada usando substrato cromogênico artificial 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-galactopiranosídeo, X-gal . β-galactosidase irá clivar a ligação glicosídica em X-gal e formar galactose e 5-bromo-4-cloro-3-hidroxiindol que dimeriza e oxida a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo, um intenso produto azul fácil de identificar e quantificar. É usado, por exemplo, em tela branca azulada . Sua produção pode ser induzida por um análogo não hidrolisável da alolactose , IPTG , que se liga e libera o repressor lac do operador lac, permitindo assim que a iniciação da transcrição prossiga.

É comumente usado em biologia molecular como um marcador repórter para monitorar a expressão gênica. Ele também exibe um fenômeno denominado α-complementação que forma a base para a triagem azul / branco de clones recombinantes. Esta enzima pode ser dividida em dois peptídeos, LacZ α e LacZ Ω , nenhum dos quais é ativo por si só, mas quando ambos estão presentes juntos, reagrupam-se espontaneamente em uma enzima funcional. Esta propriedade é explorada em muitos vetores de clonagem onde a presença do gene lacZα em um plasmídeo pode complementar em trans outro gene mutante que codifica o LacZΩ em cepas laboratoriais específicas de E. coli . No entanto, quando fragmentos de DNA são inseridos no vetor, a produção de LacZα é interrompida, as células, portanto, não mostram atividade β-galactosidase. A presença ou ausência de uma β-galactosidase ativa pode ser detectada por X-gal , que produz um corante azul característico quando clivado por β-galactosidase, proporcionando assim um meio fácil de distinguir a presença ou ausência de produto clonado em um plasmídeo. Em estudos de translocações cromossômicas de leucemia, Dobson e colegas usaram uma proteína de fusão de LacZ em camundongos, explorando a tendência da β-galactosidase de oligomerizar para sugerir um papel potencial para a oligomericidade na função da proteína de fusão MLL.

Uma nova isoforma para beta-galactosidase com atividade ótima em pH 6,0 (Senescence Associated beta-gal ou SA-beta-gal ) que é especificamente expressa na senescência (a parada irreversível do crescimento das células). Até ensaios quantitativos específicos foram desenvolvidos para sua detecção. No entanto, sabe-se agora que isso se deve a uma superexpressão e acúmulo da beta-galactosidase endógena lisossomal, e sua expressão não é necessária para a senescência. No entanto, continua sendo o biomarcador mais usado para células senescentes e envelhecidas, porque é confiável e fácil de detectar.

Evolução

Algumas espécies de bactérias, incluindo E. coli , possuem genes adicionais de β-galactosidase. Um segundo gene, denominado gene evoluído β-galactosidase ( ebgA ) foi descoberto quando cepas com o gene lacZ deletado (mas ainda contendo o gene para galactosídeo permease, lacY ), foram semeadas em meio contendo lactose (ou outros 3-galactosídeos) como único fonte de carbono. Depois de um tempo, certas colônias começaram a crescer. No entanto, a proteína EbgA é uma lactase ineficaz e não permite o crescimento com lactose. Duas classes de mutações de ponto único melhoram dramaticamente a atividade da enzima ebg em relação à lactose. e, como resultado, a enzima mutante é capaz de substituir a lacZ β-galactosidase. EbgA e LacZ são 50% idênticos no nível de DNA e 33% idênticos no nível de aminoácidos. A enzima ebg ativa é um agregado de produtos do gene ebgA e dos genes ebgC em uma proporção de 1: 1 com a forma ativa das enzimas ebg sendo um hetero-octâmero α 4 β4.

Distribuição de espécies

Muito do trabalho realizado na β-galactosidase é derivado de E. coli. No entanto, β-gal pode ser encontrado em muitas plantas (especialmente frutas), mamíferos, leveduras, bactérias e fungos. Os genes da β-galactosidase podem diferir no comprimento de sua sequência de codificação e no comprimento das proteínas formadas pelos aminoácidos. Isso separa as β-galactosidases em quatro famílias: GHF-1, GHF-2, GHF-35 e GHF-42. E. Coli pertence ao GHF-2, todas as plantas pertencem ao GHF-35 e Thermus thermophilus pertence ao GHF -42. Vários frutos podem expressar múltiplos genes β-gal. Existem pelo menos 7 genes β-gal expressos no desenvolvimento do tomate, que apresentam similaridade de aminoácidos entre 33% e 79%. Um estudo com o objetivo de identificar o amolecimento de frutas de pêssegos encontrou 17 expressões gênicas diferentes de β-galactosidases. A única outra estrutura cristalina conhecida de β-gal é de Thermus thermophilus .

Referências

links externos

• beta-galactosidase nos cabeçalhos de assuntos médicos da Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA (MeSH)