Ativação transcricional controlada por tetraciclina - Tetracycline-controlled transcriptional activation
A ativação transcricional controlada por tetraciclina é um método de expressão gênica induzível em que a transcrição é reversivelmente ligada ou desligada na presença do antibiótico tetraciclina ou de um de seus derivados (por exemplo, doxiciclina ).
A expressão gênica controlada pela tetraciclina é baseada no mecanismo de resistência ao tratamento com antibióticos tetraciclina encontrado em bactérias gram-negativas . Na natureza, o promotor P tet expressa TetR, o repressor , e TetA, a proteína que bombeia o antibiótico tetraciclina para fora da célula.
A diferença entre Tet-On e Tet-Off não é se o transativador liga ou desliga um gene, como o nome pode sugerir; em vez disso, ambas as proteínas ativam a expressão. A diferença está relacionada à sua resposta respectiva à tetraciclina ou doxiciclina (Dox, um análogo mais estável da tetraciclina); Tet-Off ativa a expressão na ausência de Dox, enquanto Tet-On ativa na presença de Dox.
Tet-Off e Tet-On
Os dois sistemas de expressão induzível mais comumente usados para a pesquisa da biologia de células eucariotas são denominados Tet-Off e Tet-On. O sistema Tet-Off para controlar a expressão de genes de interesse em células de mamíferos foi desenvolvido pelos professores Hermann Bujard e Manfred Gossen na Universidade de Heidelberg e publicado pela primeira vez em 1992.
O sistema Tet-Off faz uso da proteína transativadora de tetraciclina (tTA) , que é criada pela fusão de uma proteína , TetR (repressor de tetraciclina), encontrada na bactéria Escherichia coli , com o domínio de ativação de outra proteína, VP16 , encontrada no herpes vírus simplex .
A proteína tTA resultante é capaz de se ligar ao DNA em sequências de operadores TetO específicas . Na maioria dos sistemas Tet-Off, várias repetições de tais sequências TetO são colocadas a montante de um promotor mínimo , como o promotor CMV . A totalidade de várias sequências TetO com um promotor mínimo é chamada de elemento de resposta à tetraciclina (TRE), porque responde à ligação da proteína transativadora de tetraciclina tTA por expressão aumentada do gene ou genes a jusante de seu promotor.
Em um sistema Tet-Off, a expressão de genes controlados por TRE pode ser reprimida pela tetraciclina e seus derivados. Eles se ligam a tTA e o tornam incapaz de se ligar a sequências de TRE, evitando assim a transativação de genes controlados por TRE.
Um sistema Tet-On funciona de maneira semelhante, mas de maneira oposta. Enquanto em um sistema Tet-Off, tTA é capaz de se ligar ao operador apenas se não for ligado à tetraciclina ou a um de seus derivados, como a doxiciclina, em um sistema Tet-On, a proteína rtTA é capaz de se ligar ao operador apenas se ligada por uma tetraciclina. Assim, a introdução da doxiciclina no sistema inicia a transcrição do produto genético. O sistema Tet-On às vezes é preferível ao Tet-Off por sua capacidade de resposta mais rápida.
Os sistemas de expressão Tet-Off também são usados na geração de camundongos transgênicos que expressam condicionalmente o gene de interesse.
Tet-On Advanced e Tet-On 3G
O transativador Tet-On Advanced (também conhecido como rtTA2 S -M2) é uma versão alternativa do Tet-On que mostra expressão basal reduzida e funciona em uma concentração de Dox 10 vezes menor do que o Tet-Off. Além disso, sua expressão é considerada mais estável em células eucarióticas por ser humano com códon otimizado e utilizar três domínios mínimos de ativação transcricional. Foi descoberto em 2000 como um dos dois mutantes melhorados por H. Bujard e seus colegas após mutagênese aleatória da parte repressora de Tet do gene transativador. Tet-On 3G (também conhecido como rtTA-V10) é semelhante ao Tet-On Advanced, mas foi derivado de rtTA2 S -S2 em vez de rtTA2 S -M2. É também otimizado por códons humanos e composto por três domínios de ativação VP16 mínimos. No entanto, a proteína Tet-On 3G tem cinco diferenças de aminoácidos em comparação com Tet-On Advanced, que parecem aumentar sua sensibilidade ao Dox ainda mais. O Tet-On 3G é sensível a Dox 100 vezes menos e é sete vezes mais ativo do que o Tet-On original.
Outros sistemas
Outros sistemas, como o sistema T-REx da Life Technologies, funcionam de maneira diferente. O gene de interesse é flanqueado por um promotor CMV a montante e dois locais TetO2. A expressão do gene de interesse é reprimida pela ligação de alta afinidade de homodímeros TetR a cada sequência de TetO2 na ausência de tetraciclina. A introdução de tetraciclina resulta na ligação de uma tetraciclina em cada homodímero TetR seguida pela liberação de TetO2 pelos homodímeros TetR. A desvinculação de homodímeros TetR e TetO2 resulta na desrepressão do gene de interesse.
Uma versão modificada do T-REx é o circuito biológico sintético Linearizer , otimizado para o ajuste da expressão gênica em células eucarióticas (fermento de brotamento, humano, etc.). Ao incorporar locais de TetO2 no promotor que direciona a expressão de TetR, ele cria feedback negativo , que garante uma expressão homogênea (baixo ruído) e uma dose-resposta linear aos análogos de tetraciclina.
Elemento de resposta de tetraciclina (TRE)
Nos plasmídeos mais comumente usados , o elemento de resposta à tetraciclina consiste em sete repetições da sequência TetO bacteriana de 19 pb (TCCCTATCAGTGATAGAGA) separadas por sequências espaçadoras (por exemplo: ACGATGTCGAGTTTAC). É o TetO que é reconhecido e limitado pela porção TetR do Tet-On ou Tet-Off. O TRE é geralmente colocado a montante de um promotor mínimo que tem expressão basal muito baixa na ausência de Tet-Off (ou Tet-On) ligado.
Vantagens e desvantagens
O sistema Tet tem vantagens sobre os sistemas de expressão gênica condicional Cre , FRT e ER (receptor de estrogênio). Nos sistemas Cre e FRT, a ativação ou nocaute do gene é irreversível uma vez que a recombinação é realizada, ao passo que, nos sistemas Tet e ER, é reversível. O sistema Tet tem um controle muito rígido sobre a expressão, enquanto o sistema ER é um tanto furado. No entanto, o sistema Tet, que depende da transcrição e subsequente tradução de um gene alvo, não é de ação tão rápida quanto o sistema ER, que estabiliza a proteína alvo já expressa após a administração de hormônio. Além disso, uma vez que a sequência tet-o de 19 pb está naturalmente ausente nas células de mamíferos, acredita-se que a pleiotropia seja minimizada em comparação com os métodos hormonais de controle. Ao usar o sistema Tet em cultura de células, é importante confirmar que cada lote de soro fetal bovino seja testado para confirmar que as tetraciclinas contaminantes estão ausentes ou são muito baixas para interferir na indutibilidade.
O mecanismo de ação para o efeito antibacteriano das tetraciclinas depende da interrupção da tradução de proteínas nas bactérias, danificando assim a capacidade dos micróbios de crescer e se reparar; no entanto, a tradução de proteínas também é interrompida nas mitocôndrias eucarióticas, levando a efeitos que podem confundir os resultados experimentais.