Purificação de proteínas - Protein purification
A purificação de proteínas é uma série de processos destinados a isolar uma ou algumas proteínas de uma mistura complexa, geralmente células , tecidos ou organismos inteiros. A purificação de proteínas é vital para a especificação da função, estrutura e interações da proteína de interesse. O processo de purificação pode separar as partes proteicas e não proteicas da mistura e, finalmente, separar a proteína desejada de todas as outras proteínas. A separação de uma proteína de todas as outras é normalmente o aspecto mais trabalhoso da purificação de proteínas. As etapas de separação geralmente exploram diferenças no tamanho da proteína, propriedades físico-químicas, afinidade de ligação e atividade biológica . O resultado puro pode ser denominado isolado de proteína .
Propósito
A purificação de proteínas é preparativa ou analítica . As purificações preparativas visam produzir uma quantidade relativamente grande de proteínas purificadas para uso subsequente. Os exemplos incluem a preparação de produtos comerciais, como enzimas (por exemplo, lactase ), proteínas nutricionais (por exemplo, proteína isolada de soja ) e certos biofármacos (por exemplo, insulina ). Várias etapas de purificação preparativa são frequentemente implantadas para remover bi-produtos, como proteínas de células hospedeiras , que representam uma ameaça potencial à saúde do paciente. A purificação analítica produz uma quantidade relativamente pequena de uma proteína para uma variedade de pesquisas ou propósitos analíticos, incluindo identificação, quantificação e estudos da estrutura da proteína , modificações pós-tradução e função. Pepsina e urease foram as primeiras proteínas purificadas a ponto de poderem ser cristalizadas.
Etapas preliminares
Extração
Se a proteína de interesse não é secretada pelo organismo para a solução circundante, a primeira etapa de cada processo de purificação é a ruptura das células que contêm a proteína. Dependendo de quão frágil é a proteína e quão estável as células são, pode-se, por exemplo, usar um dos seguintes métodos: i) congelamento e descongelamento repetidos, ii) sonicação , iii) homogeneização por alta pressão ( prensa francesa ), iv ) homogeneização por moagem (moinho de esferas) ev) permeabilização por detergentes (por exemplo, Triton X-100 ) e / ou enzimas (por exemplo, lisozima ). Finalmente, os resíduos celulares podem ser removidos por centrifugação, de modo que as proteínas e outros compostos solúveis permaneçam no sobrenadante.
Além disso, as proteases são liberadas durante a lise celular , que começará a digerir as proteínas da solução. Se a proteína de interesse for sensível à proteólise , recomenda-se proceder rapidamente e manter o extrato resfriado para retardar a digestão. Alternativamente, um ou mais inibidores de protease podem ser adicionados ao tampão de lise imediatamente antes da ruptura celular. Às vezes, também é necessário adicionar DNAse para reduzir a viscosidade do lisado celular causada por um alto conteúdo de DNA .
Precipitação e solubilização diferencial
Na purificação de proteínas em massa, um primeiro passo comum para isolar proteínas é a precipitação com sulfato de amônio (NH 4 ) 2 SO 4 . Isso é realizado pela adição de quantidades crescentes de sulfato de amônio e pela coleta das diferentes frações de proteína precipitada. Posteriormente, o sulfato de amônio pode ser removido por diálise . Durante a etapa de precipitação do sulfato de amônio, grupos hidrofóbicos presentes nas proteínas são expostos à atmosfera, atraindo outros grupos hidrofóbicos; o resultado é a formação de um agregado de componentes hidrofóbicos. Nesse caso, o precipitado de proteína será normalmente visível a olho nu . Uma vantagem desse método é que ele pode ser executado de maneira econômica, mesmo com volumes muito grandes.
As primeiras proteínas a serem purificadas são proteínas solúveis em água. A purificação das proteínas integrais da membrana requer a ruptura da membrana celular para isolar qualquer proteína particular de outras que estão no mesmo compartimento da membrana. Às vezes, uma determinada fração de membrana pode ser isolada primeiro, como isolar mitocôndrias de células antes de purificar uma proteína localizada em uma membrana mitocondrial. Um detergente tais como sódio dodecil sulfato (SDS) pode ser utilizado para dissolver as membranas celulares e proteínas da membrana manter em solução durante a purificação; no entanto, como o SDS causa desnaturação , detergentes mais suaves, como Triton X-100 ou CHAPS, podem ser usados para reter a conformação nativa da proteína durante a purificação completa.
Ultracentrifugação
A centrifugação é um processo que usa a força centrífuga para separar misturas de partículas de massas ou densidades variadas suspensas em um líquido. Quando um vaso (normalmente um tubo ou garrafa) contendo uma mistura de proteínas ou outro material particulado, como células bacterianas, é girado em altas velocidades, a inércia de cada partícula produz uma força na direção da velocidade das partículas que é proporcional a sua massa. A tendência de uma determinada partícula de se mover através do líquido por causa dessa força é compensada pela resistência que o líquido exerce sobre a partícula. O efeito líquido de "girar" a amostra em uma centrífuga é que partículas massivas, pequenas e densas se movem para fora mais rápido do que partículas menos massivas ou partículas com mais "arrasto" no líquido. Quando as suspensões de partículas são "giradas" em uma centrífuga, um "pellet" pode se formar no fundo do recipiente que é enriquecido para as partículas mais massivas com baixo arrasto no líquido.
As partículas não compactadas permanecem principalmente no líquido denominado "sobrenadante" e podem ser removidas do recipiente, separando assim o sobrenadante do pellet. A taxa de centrifugação é determinada pela aceleração angular aplicada à amostra, normalmente medida em comparação com o g . Se as amostras forem centrifugadas por tempo suficiente, as partículas no recipiente atingirão o equilíbrio em que as partículas se acumulam especificamente em um ponto no recipiente onde sua densidade flutuante é equilibrada com a força centrífuga. Essa centrifugação de "equilíbrio" pode permitir a purificação extensiva de uma determinada partícula.
Centrifugação de gradiente de sacarose - um gradiente de concentração linear de açúcar (normalmente sacarose, glicerol ou um meio de gradiente de densidade à base de sílica, como Percoll ) é gerado em um tubo de forma que a concentração mais alta esteja na parte inferior e a mais baixa no topo. Percoll é uma marca comercial de propriedade das empresas GE Healthcare. Uma amostra de proteína é então colocada em camadas no topo do gradiente e girada em alta velocidade em uma ultracentrífuga . Isso faz com que macromoléculas pesadas migrem para o fundo do tubo mais rápido do que o material mais leve. Durante a centrifugação na ausência de sacarose, conforme as partículas se movem cada vez mais longe do centro de rotação, elas experimentam mais e mais força centrífuga (quanto mais longe elas se movem, mais rápido elas se movem). O problema com isso é que a faixa de separação útil dentro do navio é restrita a uma pequena janela observável. Girar uma amostra duas vezes mais não significa que a partícula de interesse irá duas vezes mais longe; na verdade, irá significativamente mais longe. No entanto, quando as proteínas se movem através de um gradiente de sacarose, elas encontram um líquido de densidade e viscosidade crescentes. Um gradiente de sacarose adequadamente projetado irá neutralizar o aumento da força centrífuga, de forma que as partículas se movam em proporção próxima ao tempo que estiveram no campo centrífugo. As amostras separadas por estes gradientes são referidas como centrifugações de "taxa zonal". Depois de separar as proteínas / partículas, o gradiente é então fracionado e coletado.
Estratégias de purificação
A escolha de uma matéria-prima é a chave para o projeto de um processo de purificação. Em uma planta ou animal, uma determinada proteína geralmente não é distribuída homogeneamente por todo o corpo; diferentes órgãos ou tecidos têm concentrações maiores ou menores da proteína. O uso de apenas os tecidos ou órgãos com a concentração mais alta diminui os volumes necessários para produzir uma determinada quantidade de proteína purificada. Se a proteína estiver presente em baixa abundância, ou se tiver um valor alto, os cientistas podem usar a tecnologia do DNA recombinante para desenvolver células que irão produzir grandes quantidades da proteína desejada (isso é conhecido como um sistema de expressão ). A expressão recombinante permite que a proteína seja marcada, por exemplo, por um His-tag ou Strep-tag para facilitar a purificação, reduzindo o número de etapas de purificação necessárias.
Uma purificação analítica geralmente utiliza três propriedades para separar proteínas. Em primeiro lugar, as proteínas podem ser purificadas de acordo com seus pontos isoelétricos, executando-as através de um gel de pH graduado ou uma coluna de troca iônica. Em segundo lugar, as proteínas podem ser separadas de acordo com seu tamanho ou peso molecular por meio de cromatografia de exclusão de tamanho ou por análise de SDS-PAGE (eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida). As proteínas são frequentemente purificadas usando 2D-PAGE e, em seguida, analisadas por impressão digital de massa de peptídeo para estabelecer a identidade da proteína. Isso é muito útil para fins científicos e os limites de detecção de proteínas são hoje em dia muito baixos e quantidades de nanogramas de proteína são suficientes para sua análise. Em terceiro lugar, as proteínas podem ser separadas por polaridade / hidrofobicidade por meio de cromatografia líquida de alto desempenho ou cromatografia de fase reversa .
Normalmente, um protocolo de purificação de proteínas contém uma ou mais etapas cromatográficas. O procedimento básico em cromatografia é fazer fluir a solução contendo a proteína por uma coluna cheia de vários materiais. Proteínas diferentes interagem de maneira diferente com o material da coluna e, portanto, podem ser separadas pelo tempo necessário para passar na coluna ou pelas condições necessárias para eluir a proteína da coluna. Normalmente, as proteínas são detectadas à medida que saem da coluna pela sua absorvância a 280 nm. Existem muitos métodos cromatográficos diferentes:
Cromatografia de exclusão de tamanho
A cromatografia pode ser usada para separar a proteína em solução ou em condições desnaturantes usando géis porosos. Esta técnica é conhecida como cromatografia de exclusão de tamanho . O princípio é que moléculas menores precisam atravessar um volume maior em uma matriz porosa. Consequentemente, as proteínas de uma certa faixa de tamanho exigirão um volume variável de eluente (solvente) antes de serem coletadas na outra extremidade da coluna de gel.
No contexto da purificação de proteínas, o eluente é geralmente agrupado em diferentes tubos de ensaio. Todos os tubos de ensaio que não contêm vestígios mensuráveis da proteína a purificar são eliminados. A solução restante é, portanto, feita da proteína a purificar e quaisquer outras proteínas de tamanho semelhante.
Separação com base na carga ou hidrofobicidade
Cromatografia de interação hidrofóbica
O meio HIC é anfifílico, com regiões hidrofóbicas e hidrofílicas, permitindo a separação de proteínas com base em sua hidrofobicidade de superfície. As proteínas alvo e suas espécies agregadas de produto tendem a ter diferentes propriedades hidrofóbicas e removê-las via HIC purifica ainda mais a proteína de interesse. Além disso, o ambiente usado normalmente emprega condições de desnaturação menos severas do que outras técnicas de cromatografia, ajudando assim a preservar a proteína de interesse em seu estado nativo e funcional. Em água pura, as interações entre a resina e as regiões hidrofóbicas da proteína seriam muito fracas, mas essa interação é aumentada pela aplicação de uma amostra de proteína à resina HIC em tampão de alta força iônica. A força iônica do tampão é então reduzida para eluir proteínas a fim de diminuir a hidrofobicidade.
Cromatografia de troca iônica
A cromatografia de troca iônica separa os compostos de acordo com a natureza e o grau de sua carga iônica. A coluna a ser usada é selecionada de acordo com seu tipo e força de carga. As resinas de troca aniônica têm uma carga positiva e são usadas para reter e separar compostos carregados negativamente (ânions), enquanto as resinas de troca catiônica têm uma carga negativa e são usadas para separar moléculas carregadas positivamente (cátions).
Antes que a separação comece, um buffer é bombeado através da coluna para equilibrar os íons carregados opostos. Após a injeção da amostra, as moléculas de soluto serão trocadas com os íons do tampão à medida que cada um compete pelos locais de ligação na resina. O comprimento de retenção para cada soluto depende da força de sua carga. Os compostos com carga mais fraca eluirão primeiro, seguidos por aqueles com cargas sucessivamente mais fortes. Devido à natureza do mecanismo de separação, pH, tipo de tampão, concentração de tampão e temperatura, todos desempenham papéis importantes no controle da separação.
A cromatografia de troca iônica é uma ferramenta muito poderosa para uso na purificação de proteínas e é freqüentemente usada em separações analíticas e preparativas.
Eletroforese de fluxo livre
A eletroforese de fluxo livre (FFE) é uma técnica de eletroforese sem carreador que permite a separação preparativa de proteínas em um fluxo de buffer laminar usando um campo elétrico ortogonal. Fazendo uso de um gradiente de pH, que pode, por exemplo, ser induzido por anfólitos , esta técnica permite separar isoformas de proteínas até uma resolução de <0,02 delta-pI.
Cromatografia de afinidade
A cromatografia de afinidade é uma técnica de separação baseada na conformação molecular, que freqüentemente utiliza resinas específicas para aplicações. Essas resinas possuem ligantes fixados em suas superfícies que são específicos para os compostos a serem separados. Mais frequentemente, esses ligantes funcionam de maneira semelhante à das interações anticorpo-antígeno. Este ajuste de "chave e fechadura" entre o ligante e seu composto alvo o torna altamente específico, frequentemente gerando um único pico, enquanto todo o resto na amostra não é retido.
Muitas proteínas de membrana são glicoproteínas e podem ser purificadas por cromatografia de afinidade com lectina . As proteínas solubilizadas em detergente podem ser ligadas a uma resina de cromatografia que foi modificada para ter uma lectina ligada covalentemente. As proteínas que não se ligam à lectina são lavadas e, em seguida, as glicoproteínas especificamente ligadas podem ser eluídas pela adição de uma alta concentração de um açúcar que compete com as glicoproteínas ligadas no local de ligação da lectina. Algumas lectinas têm ligação de alta afinidade a oligossacarídeos de glicoproteínas que são difíceis de competir com açúcares, e as glicoproteínas ligadas precisam ser liberadas por desnaturação da lectina.
Cromatografia de imunoafinidade
A cromatografia de imunoafinidade usa a ligação específica de um anticorpo- antígeno para purificar seletivamente a proteína alvo. O procedimento envolve a imobilização de uma proteína em um substrato sólido (por exemplo, uma esfera porosa ou uma membrana), que então se liga seletivamente ao alvo, enquanto todo o resto flui através dele. A proteína alvo pode ser eluída alterando o pH ou a salinidade . O ligante imobilizado pode ser um anticorpo (como a imunoglobulina G ) ou pode ser uma proteína (como a proteína A ). Como esse método não envolve engenharia em uma tag, ele pode ser usado para proteínas de fontes naturais.
Purificação de uma proteína marcada
Outra forma de marcar proteínas é projetar um marcador de peptídeo de antígeno na proteína e, em seguida, purificar a proteína em uma coluna ou incubando com uma resina solta que é revestida com um anticorpo imobilizado . Este procedimento específico é conhecido como imunoprecipitação . A imunoprecipitação é perfeitamente capaz de gerar uma interação extremamente específica que geralmente resulta na ligação apenas da proteína desejada. As proteínas marcadas purificadas podem então ser facilmente separadas das outras proteínas em solução e, posteriormente, eluídas de volta para a solução limpa.
Quando as tags não são mais necessárias, elas podem ser clivadas por uma protease. Isso geralmente envolve a engenharia de um local de clivagem de protease entre a tag e a proteína.
HPLC
A cromatografia líquida de alto desempenho ou cromatografia líquida de alta pressão é uma forma de cromatografia que aplica alta pressão para conduzir os solutos através da coluna mais rapidamente. Isso significa que a difusão é limitada e a resolução melhorada. A forma mais comum é HPLC de "fase reversa", em que o material da coluna é hidrofóbico . As proteínas são eluídas por um gradiente de quantidades crescentes de um solvente orgânico , como o acetonitrila. As proteínas eluem de acordo com sua hidrofobicidade. Após a purificação por HPLC, a proteína está em uma solução que contém apenas compostos voláteis e pode ser facilmente liofilizada. A purificação por HPLC frequentemente resulta na desnaturação das proteínas purificadas e, portanto, não é aplicável a proteínas que não se redobram espontaneamente.
Concentração da proteína purificada
No final de uma purificação de proteína, a proteína frequentemente precisa ser concentrada. Existem diferentes métodos.
Liofilização
Se a solução não contiver nenhum outro componente solúvel além da proteína em questão, a proteína pode ser liofilizada (seca). Isso geralmente é feito após uma execução de HPLC. Isso simplesmente remove todos os componentes voláteis, deixando as proteínas para trás.
Ultrafiltração
A ultrafiltração concentra uma solução de proteína usando membranas permeáveis seletivas. A função da membrana é permitir a passagem de água e pequenas moléculas, retendo a proteína. A solução é forçada contra a membrana por bomba mecânica, pressão de gás ou centrifugação.
Avaliação do rendimento de purificação
O método mais geral para monitorar o processo de purificação é executando uma SDS-PAGE com as diferentes etapas. Este método fornece apenas uma medida aproximada das quantidades de diferentes proteínas na mistura e não é capaz de distinguir entre proteínas com peso molecular aparente semelhante .
Se a proteína tem uma característica espectroscópica distinta ou uma atividade enzimática , esta propriedade pode ser usada para detectar e quantificar a proteína específica e, assim, selecionar as frações da separação que contém a proteína. Se os anticorpos contra a proteína estão disponíveis em seguida, transferência de western e ELISA pode especificamente detectar e quantificar a quantidade de protea desejada. Algumas proteínas funcionam como receptores e podem ser detectadas durante as etapas de purificação por um ensaio de ligação ao ligante , geralmente usando um ligante radioativo .
Para avaliar o processo de purificação em várias etapas, a quantidade da proteína específica deve ser comparada com a quantidade de proteína total. Este último pode ser determinado pelo ensaio de proteína total de Bradford ou por absorbância de luz a 280 nm , porém alguns reagentes usados durante o processo de purificação podem interferir na quantificação. Por exemplo, o imidazol (comumente usado para purificação de proteínas recombinantes marcadas com poli-histidina) é um análogo de aminoácido e em baixas concentrações irá interferir com o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) para quantificação de proteína total. As impurezas no imidazol de baixo grau também serão absorvidas a 280 nm, resultando em uma leitura imprecisa da concentração de proteína da absorbância de UV.
Outro método a ser considerado é a ressonância de plasma de superfície (SPR). O SPR pode detectar a ligação de moléculas sem rótulo na superfície de um chip. Se a proteína desejada for um anticorpo, a ligação pode ser traduzida diretamente para a atividade da proteína. Pode-se expressar a concentração ativa da proteína como a porcentagem da proteína total. SPR pode ser um método poderoso para determinar rapidamente a atividade da proteína e o rendimento geral. É uma tecnologia poderosa que requer um instrumento para funcionar.
Analítico
Eletroforese de condição desnaturante
A eletroforese em gel é uma técnica laboratorial comum que pode ser usada tanto como método preparativo quanto analítico. O princípio da eletroforese se baseia no movimento de um íon carregado em um campo elétrico. Na prática, as proteínas são desnaturadas em uma solução contendo um detergente ( SDS ). Nessas condições, as proteínas são desdobradas e revestidas com moléculas de detergente carregadas negativamente. As proteínas em SDS-PAGE são separadas apenas com base em seu tamanho.
Em métodos analíticos, a proteína migra como bandas com base no tamanho. Cada banda pode ser detectada usando manchas como corante azul Coomassie ou mancha de prata . Métodos preparativos para purificar grandes quantidades de proteínas, requerem a extração da proteína do gel eletroforético. Esta extração pode envolver a excisão do gel contendo uma banda, ou eluição da banda diretamente do gel à medida que escorre para o final do gel.
No contexto de uma estratégia de purificação, a eletroforese de condição desnaturante fornece uma resolução melhorada sobre a cromatografia de exclusão de tamanho, mas não escala para grandes quantidades de proteínas em uma amostra, bem como nas colunas de cromatografia tardia .
Eletroforese em condição não desnaturante
Um procedimento eletroforético não desnaturante para isolar metaloproteínas bioativas em misturas de proteínas complexas é a PAGE nativa preparativa. A integridade ou integridade estrutural da proteína isolada deve ser confirmada por um método independente.