Lisozima - Lysozyme

Glicosídeo hidrolase, família 22, lisozima
Lysozymecrystals1.png
Cristais de lisozima corados com azul de metileno .
Identificadores
Símbolo ?
InterPro IPR000974
Lisozima
Identificadores
EC nº 3.2.1.17
CAS no. 9001-63-2
Bancos de dados
IntEnz Vista IntEnz
BRENDA Entrada BRENDA
ExPASy NiceZyme view
KEGG Entrada KEGG
MetaCyc via metabólica
PRIAM perfil
Estruturas PDB RCSB PDB PDBe PDBsum
Ontologia Genética AmiGO / QuickGO

A lisozima , também conhecida como muramidase ou N-acetilmuramida glicanidrolase , é uma enzima antimicrobiana produzida por animais que faz parte do sistema imunológico inato . A lisozima é uma glicosídeo hidrolase que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta entre o ácido N-acetilmurâmico e os resíduos de N-acetil-D-glucosamina no peptidoglicano , que é o principal componente da parede celular bacteriana gram-positiva . Essa hidrólise, por sua vez, compromete a integridade das paredes das células bacterianas, causando a lise das bactérias.

A lisozima é abundante em secreções, incluindo lágrimas , saliva , leite humano e muco . Também está presente nos grânulos citoplasmáticos dos macrófagos e dos neutrófilos polimorfonucleares (PMNs). Grandes quantidades de lisozima podem ser encontradas na clara do ovo . As lisozimas do tipo C estão intimamente relacionadas à alfa-lactalbumina em sequência e estrutura, tornando-as parte da mesma família das glicosídeos hidrolases 22 . Em humanos, a enzima lisozima do tipo C é codificada pelo gene LYZ .

A lisozima de clara de ovo de galinha é termicamente estável, com ponto de fusão de até 72 ° C em pH 5,0. No entanto, a lisozima no leite humano perde atividade muito rapidamente nessa temperatura. A lisozima de clara de ovo de galinha mantém sua atividade em uma ampla faixa de pH (6-9). Seu ponto isoelétrico é 11,35. O ponto isoelétrico da lisozima do leite humano é 10,5-11.

Função e mecanismo

A enzima funciona hidrolisando ligações glicosídicas em peptidoglicanos . A enzima também pode quebrar as ligações glicosídicas da quitina , embora não seja tão eficaz quanto as quitinases verdadeiras .

Visão geral da reação catalisada pela lisozima

O sítio ativo da lisozima se liga à molécula de peptidoglicano na fenda proeminente entre seus dois domínios. Ele ataca os peptidoglicanos (encontrados nas paredes celulares das bactérias, principalmente bactérias Gram-positivas ), seu substrato natural, entre o ácido N- acetilmurâmico (NAM) e o quarto átomo de carbono da N-acetilglucosamina (NAG).

Mais curtos sacarídeos como tetrassacárido também têm mostrado ser substratos viáveis mas através de um intermediário com uma cadeia mais longa. A quitina também demonstrou ser um substrato de lisozima viável. Substratos artificiais também foram desenvolvidos e usados ​​na lisozima.

Mecanismo

Phillips

O mecanismo de Phillips propôs que o poder catalítico da enzima veio tanto da tensão estérica no substrato ligado quanto da estabilização eletrostática de um intermediário oxo-carbênio . A partir de dados cristalográficos de raios-X, Phillips propôs o sítio ativo da enzima, onde um hexassacarídeo se liga. A lisozima distorce o quarto açúcar (no subsite D ou -1) no hexassacarídeo em uma conformação de meia cadeira. Nesse estado de estresse, a ligação glicosídica é quebrada com mais facilidade. Um intermediário iônico contendo um oxo-carbênio é criado como resultado da quebra da ligação glicosídica. Assim, a distorção que faz com que a molécula do substrato adote uma conformação deformada semelhante à do estado de transição irá diminuir a barreira de energia da reação.

O intermediário oxo-carbonium proposto foi especulado para ser eletrostaticamente estabilizado por resíduos de aspartato e glutamato no sítio ativo por Arieh Warshel em 1978. O argumento de estabilização eletrostática foi baseado na comparação com água bruta, a reorientação de dipolos de água pode cancelar a energia estabilizadora de interação de carga. No modelo de Warshel, a enzima atua como um super-solvente, que fixa a orientação dos pares de íons e fornece supersolvação (estabilização muito boa dos pares de íons) e, especialmente, diminui a energia quando dois íons estão próximos um do outro.

A etapa de determinação da taxa (RDS) neste mecanismo está relacionada à formação do intermediário oxo-carbênio . Houve alguns resultados contraditórios para indicar o RDS exato. Ao rastrear a formação do produto ( p-nitrofenol ), descobriu-se que o RDS pode mudar em diferentes temperaturas, o que foi um motivo para esses resultados contraditórios. Em uma temperatura mais alta, o RDS é a formação de um intermediário de enzima glicosil e em uma temperatura mais baixa, a quebra desse intermediário.

Intermediário covalente da enzima lisozima, com ligação covalente em preto e evidência experimental em malha azul.

Koshland

Substratos no experimento de Vocadlo

Em um debate inicial em 1969, Dahlquist propôs um mecanismo covalente para a lisozima com base no efeito do isótopo cinético , mas por um longo tempo o mecanismo iônico foi mais aceito. Em 2001, um mecanismo revisado foi proposto por Vocadlo por meio de um intermediário covalente, mas não iônico. A evidência da análise ESI - MS indicou um intermediário covalente. Um substrato substituído com 2 fluoro foi usado para diminuir a taxa de reação e acumular um intermediário para a caracterização. Verificou-se que as cadeias laterais de aminoácidos ácido glutâmico 35 (Glu35) e aspartato 52 (Asp52) são críticas para a atividade desta enzima. Glu35 atua como um doador de prótons para a ligação glicosídica, clivando a ligação CO no substrato, enquanto Asp52 atua como um nucleófilo para gerar um intermediário de enzima glicosil. O Glu35 reage com água para formar íon hidroxila, um nucleófilo mais forte que a água, que então ataca o intermediário da enzima glicosila, para dar o produto da hidrólise e deixar a enzima inalterada. Este mecanismo covalente foi nomeado após Koshland , que primeiro propôs este tipo de mecanismo.

Mais recentemente, a mecânica quântica / mecânica molecular (QM / MM) de dinâmica molecular simulações têm vindo a utilizar o cristal de HEWL e prever a existência de um intermediário covalente. Evidências para ESI-MS e estruturas de raios-X indicam a existência de intermediário covalente, mas principalmente se baseiam no uso de um mutante menos ativo ou substrato não nativo. Assim, a dinâmica molecular QM / MM fornece a capacidade única de investigar diretamente o mecanismo de HEWL de tipo selvagem e substrato nativo. Os cálculos revelaram que o intermediário covalente do mecanismo de Koshland é ~ 30 kcal / mol mais estável do que o intermediário iônico do mecanismo de Phillips. Estes cálculos demonstram que o intermediário iônico é extremamente desfavorável energeticamente e os intermediários covalentes observados a partir de experimentos usando substratos mutantes ou não nativos menos ativos fornecem informações úteis sobre o mecanismo de HEWL de tipo selvagem.

Dois mecanismos possíveis de lisozima

Inibição

Os derivados de imidazol podem formar um complexo de transferência de carga com alguns resíduos (dentro ou fora do centro ativo) para obter uma inibição competitiva da lisozima. Em bactérias Gram-negativas , o lipopolissacarídeo atua como um inibidor não competitivo por ligação altamente favorecida com a lisozima.

Ação não enzimática

Apesar de a atividade da muramidase da lisozima ter desempenhado um papel fundamental em suas propriedades antibacterianas, também foram relatadas evidências de sua ação não enzimática. Por exemplo, o bloqueio da atividade catalítica da lisozima por mutação do aminoácido crítico no sítio ativo (52- Asp -> 52- Ser ) não elimina sua atividade antimicrobiana. A capacidade semelhante à lectina da lisozima em reconhecer o antígeno de carboidrato bacteriano sem atividade lítica foi relatada para tetrassacarídeo relacionado ao lipopolissacarídeo de Klebsiella pneumoniae . Além disso, lisozima interage com anticorpos e receptores das células T .

Mudanças na conformação da enzima

A lisozima exibe duas conformações: um estado ativo aberto e um estado inativo fechado. A relevância catalítica foi examinada com nanotubos de carbono de parede única (SWCN) transistores de efeito de campo (FETs), onde uma lisozima singular foi ligada ao SWCN FET. O monitoramento eletrônico da lisozima mostrou duas conformações, um local ativo aberto e um local inativo fechado. Em seu estado ativo, a lisozima é capaz de hidrolisar processamente seu substrato, quebrando em média 100 ligações a uma taxa de 15 por segundo. Para ligar um novo substrato e passar do estado inativo fechado para o estado ativo aberto, são necessárias duas mudanças na etapa de conformação, enquanto a inativação requer uma etapa.

Papel na doença e terapia

LYZ
Estruturas disponíveis
PDB Pesquisa Ortholog: PDBe RCSB
Identificadores
Apelido LYZ , LZM, LYZF1, lisozima
IDs externos OMIM : 153450 MGI : 96902 HomoloGene : 121490 GeneCards : LYZ
Ortólogos
Espécies Humano Mouse
Entrez
Conjunto
UniProt
RefSeq (mRNA)

NM_000239

NM_013590

RefSeq (proteína)

NP_000230

NP_038618

Localização (UCSC) Chr 12: 69,35 - 69,35 Mb Chr 10: 117,29 - 117,29 Mb
Pesquisa PubMed
Wikidata
Ver / Editar Humano Ver / Editar Mouse

A lisozima faz parte do sistema imunológico inato. Os níveis reduzidos de lisozima têm sido associados à displasia broncopulmonar em recém-nascidos. Leitões alimentados com leite de lisozima humana podem se recuperar de doenças diarreicas causadas por E. coli mais rapidamente. A concentração de lisozima no leite humano é 1.600 a 3.000 vezes maior do que a concentração no leite de gado. A lisozima humana é mais ativa do que a lisozima de clara de ovo de galinha. Uma linha transgênica de cabras (com um fundador chamado "Artemis") foi desenvolvida para produzir leite com lisozima humana para proteger as crianças da diarreia caso elas não possam obter os benefícios da amamentação humana.

Visto que a lisozima é uma forma natural de proteção contra patógenos Gram-positivos como Bacillus e Streptococcus , ela desempenha um papel importante na imunologia de bebês na alimentação com leite humano. Enquanto a pele é uma barreira protetora devido à sua secura e acidez, a conjuntiva (membrana que cobre o olho) é, ao contrário, protegida por enzimas secretadas, principalmente lisozima e defensina . No entanto, quando essas barreiras de proteção falham, ocorre a conjuntivite .

Em certos tipos de câncer (especialmente leucemia mielomonocítica), a produção excessiva de lisozima pelas células cancerosas pode levar a níveis tóxicos de lisozima no sangue. Níveis elevados de lisozima no sangue podem levar à insuficiência renal e baixo teor de potássio no sangue, condições que podem melhorar ou remitir com o tratamento da doença maligna primária.

A lisozima sérica é muito menos específica para o diagnóstico de sarcoidose do que a enzima conversora de angiotensina sérica; no entanto, por ser mais sensível, é usado como marcador da atividade da sarcoidose e é adequado para monitoramento da doença em casos comprovados.

Síntese química

A primeira síntese química de uma proteína lisozima foi tentada pelo Prof. George W. Kenner e seu grupo na Universidade de Liverpool, na Inglaterra. Isso foi finalmente alcançado em 2007 por Thomas Durek no laboratório de Steve Kent na Universidade de Chicago, que fez uma molécula de lisozima funcional sintética.

Outras aplicações

Os cristais de lisozima têm sido usados ​​para cultivar outros materiais funcionais para catálise e aplicações biomédicas. A lisozima é uma enzima comumente usada para a lise de bactérias gram-positivas. Devido à função única da lisozima, na qual pode digerir a parede celular e causar choque osmótico (romper a célula mudando repentinamente a concentração de soluto ao redor da célula e, portanto, a pressão osmótica ), a lisozima é comumente usada em laboratório para liberar proteínas da bactéria periplasma, enquanto a membrana interna permanece selada como vesículas chamadas esferoplasto .

Por exemplo, E. coli pode ser lisada usando lisozima para liberar o conteúdo do espaço periplasmático . É especialmente útil em laboratório para tentar coletar o conteúdo do periplasma. O tratamento com lisozima é ideal em determinadas temperaturas, faixas de pH e concentrações de sal. A atividade da lisozima aumenta com o aumento das temperaturas, até 60 graus Celsius, com uma faixa de pH de 6,0-7,0. Os sais presentes também afetam o tratamento com lisozima, onde alguns afirmam efeitos inibidores e outros promovem a lise por meio do tratamento com lisozima. O cloreto de sódio induz a lise, mas em altas concentrações é um inibidor ativo da lise. Observações semelhantes foram observadas com o uso de sais de potássio. Pequenas variações estão presentes devido a diferenças nas cepas bacterianas.

História

A propriedade antibacteriana da clara de ovo de galinha, devido à lisozima que contém, foi observada pela primeira vez por Laschtschenko em 1909. A atividade de matar bactérias do muco nasal foi demonstrada em 1922 por Alexander Fleming , o descobridor da penicilina , que cunhou o termo lisozima. Fleming relatou, dizendo. "Como esta substância tem propriedades semelhantes às dos fermentos, chamei-a de 'lisozima'." Fleming passou a mostrar que uma substância enzimática estava presente em uma ampla variedade de secreções e era capaz de lisar rapidamente (isto é, dissolver) diferentes bactérias, particularmente um "coco" amarelo que ele estudou.

A lisozima foi cristalizada pela primeira vez por Edward Abraham em 1937, permitindo que a estrutura tridimensional da lisozima da clara do ovo de galinha fosse descrita por David Chilton Phillips em 1965, quando ele obteve o primeiro modelo de resolução de 2 ångström (200 pm ) por meio de cristalografia de raios-X . A estrutura foi apresentada publicamente em uma palestra do Royal Institution em 1965. A lisozima foi a segunda estrutura de proteína e a primeira estrutura de enzima a ser resolvida por meio de métodos de difração de raios-X, e a primeira enzima a ser totalmente sequenciada que contém todos os vinte aminoácidos comuns. Como resultado da elucidação de Phillips sobre a estrutura da lisozima, foi também a primeira enzima a ter um mecanismo detalhado e específico sugerido para seu método de ação catalítica. Este trabalho levou Phillips a fornecer uma explicação de como as enzimas aceleram uma reação química em termos de suas estruturas físicas. O mecanismo original proposto por Phillips foi revisado mais recentemente.

Veja também

Referências

links externos