Canal de potássio KcsA - KcsA potassium channel
KCSA ( K c hannel de s treptomyces A ) é um procariota do canal de potássio a partir da bactéria do solo Streptomyces lividans que tem sido estudados extensivamente em canal iónico pesquisa. A proteína ativada por pH possui dois segmentos transmembrana e uma região de poro altamente seletiva, responsável pela passagem e transporte de íons K + para fora da célula. A sequência de aminoácidos encontrada no filtro de seletividade de KcsA é altamente conservada entre os canais de voltagem de K + procarióticos e eucarióticos ; como resultado, a pesquisa sobre KcsA forneceu uma visão estrutural e mecanística importante na base molecular para a seleção e condução de íons K + . Como um dos canais iônicos mais estudados até hoje, KcsA é um modelo para pesquisa sobre a função do canal de K + e sua estrutura elucidada é a base da modelagem computacional da dinâmica do canal para espécies procarióticas e eucarióticas.
| Canal de potássio KcsA | |||||||||
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 As quatro subunidades que formam o canal são desenhadas em cores diferentes. Eles circundam um poro central, guardado pelo filtro de seletividade formado pelos P-loops de cada uma das subunidades. Os pontos azuis e vermelhos indicam os limites da bicamada lipídica .
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| Identificadores | |||||||||
| Símbolo | KcsA | ||||||||
| Pfam | PF07885 | ||||||||
| InterPro | IPR013099 | ||||||||
| SCOP2 | 1bl8 / SCOPe / SUPFAM | ||||||||
| Superfamília OPM | 8 | ||||||||
| Proteína OPM | 1r3j | ||||||||
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História
KcsA foi o primeiro canal de íon de potássio a ser caracterizado usando cristalografia de raios-X por Roderick MacKinnon e seus colegas em 1998. Nos anos que antecederam isso, a pesquisa sobre a estrutura dos canais de K + foi centrada no uso de pequenas toxinas que se ligam a revelar a localização do poro e filtro de seletividade entre os resíduos do canal. O grupo de MacKinnon teorizou o arranjo tetramérico dos segmentos transmembrana , e até sugeriu a presença de "loops" formadores de poros na região do filtro feitos de segmentos curtos de aminoácidos que interagiam com íons K + passando pelo canal. A descoberta de uma forte homologia de sequência entre KcsA e outros canais da família Kv, incluindo a proteína Shaker , atraíram a atenção da comunidade científica, especialmente quando a sequência de assinatura do canal K + começou a aparecer em outros genes procarióticos . A simplicidade das duas hélices transmembrana em KcsA, ao contrário das seis em muitos canais iônicos eucarióticos , também forneceu um método para entender os mecanismos de condução dos canais de K + em um nível mais rudimentar, proporcionando assim um grande impulso para o estudo de KcsA .
A estrutura cristalina de KcsA foi resolvida pelo grupo MacKinnon em 1998 após a descoberta de que a remoção do domínio citoplasmático do terminal C da proteína nativa (resíduos 126-158) aumenta a estabilidade das amostras cristalizadas. Um modelo de KcsA na resolução de 3.2A foi produzido que confirmou o arranjo tetramérico da proteína em torno de um poro central, com uma hélice de cada subunidade voltada para o eixo interno e a outra voltada para fora. Três anos depois, um modelo de resolução mais alta foi produzido por Morais-Cabral e Zhou depois que fragmentos Fab monoclonais foram anexados a cristais KcsA para estabilizar ainda mais o canal. No início dos anos 2000, surgiram evidências da ocupação do filtro de seletividade por dois átomos de K + durante o processo de transporte, com base em cálculos de energia e eletrostáticos feitos para modelar a região dos poros. A investigação contínua das várias conformações abertas e fechadas, inativas e ativas de KcsA por outros métodos de imagem, como ssNMR e EPR , desde então, forneceu ainda mais informações sobre a estrutura do canal e as forças que conduzem a mudança da inativação do canal para a condução.
Em 2007, Riek et. Al. mostraram que a abertura do canal que resulta da titulação do canal iônico de pH 7 para pH 4 corresponde a mudanças conformacionais em duas regiões: transição para o estado de troca iônica do filtro de seletividade e a abertura do arranjo de TM2 no C -terminus . Este modelo explica a capacidade do KcsA de selecionar simultaneamente íons K + e , ao mesmo tempo, ativar a condutância elétrica. Em 2011, a estrutura cristalina do KcsA de comprimento total foi resolvida para revelar que o impedimento pelos resíduos previamente truncados permite apenas a expansão direta da região de passagem do íon intercelular da proteína. Esta pesquisa fornece uma visão mais detalhada do movimento de regiões de canais separados durante a condução de íons. Atualmente, os estudos de KcsA estão focados no uso do canal procariótico como modelo para a dinâmica do canal de canais eucarióticos maiores de K + , incluindo hERG .
Estrutura
A estrutura de KcsA é a de um cone invertido , com um poro central descendo ao centro formado por duas hélices transmembrana (a hélice externa M1 e a hélice interna M2), que abrangem a bicamada lipídica . O próprio canal é um tetrâmero composto de quatro subunidades idênticas de domínio único (cada uma com duas hélices α) dispostas de forma que uma hélice M2 fique voltada para o poro central, enquanto a outra hélice M1 fica voltada para a membrana lipídica . As hélices internas são inclinadas cerca de 25 ° em relação à membrana lipídica e são ligeiramente dobradas, abrindo-se para o exterior da célula como uma flor. Essas duas hélices TM estão ligadas por um loop reentrante, disperso simetricamente em torno de um eixo comum correspondente ao poro central . A região do poro abrange aproximadamente 30 resíduos de aminoácidos e pode ser dividida em três partes: um filtro de seletividade próximo ao lado extracelular, uma cavidade dilatada cheia de água no centro e uma porta fechada perto do lado citoplasmático formado por quatro hélices M2 compactadas. Esta arquitetura é considerada altamente conservada na família dos canais de potássio , tanto em eucariotos quanto em procariotos.
O comprimento total do poro é de 45 Å, e seu diâmetro varia consideravelmente dentro das regiões distintas do túnel interno. Viajando da região intracelular para fora (de baixo para cima na imagem), o poro começa com uma região de portão formada por hélices M2 com 18 Å de diâmetro e, em seguida, abre em uma ampla cavidade (∼10 Å de diâmetro) perto do meio da membrana . Nessas regiões, os íons K + estão em contato com as moléculas de água circundantes, mas quando eles entram no canal do filtro de seletividade na parte superior, a cavidade é tão estreita que os íons K + devem liberar qualquer água hidratante para entrar na célula. Em relação à composição de aminoácidos dos resíduos de revestimento de poros dentro de KcsA, as cadeias laterais que revestem o poro interno e a cavidade são predominantemente hidrofóbicas , mas dentro do filtro de seletividade estão presentes aminoácidos polares que entram em contato com os íons K + desidratados .
Filtro de seletividade
A extremidade mais larga do cone corresponde à boca extracelular do canal composta por hélices de poros, além de um filtro de seletividade que é formado por uma sequência TVGYG , (Treonina, Valina, Glicina, Tirosina, Glicina), característica dos canais de potássio. Dentro desta região, a coordenação entre os aminoácidos TVGYG e os íons K + de entrada permite a condução dos íons através do canal. O filtro de seletividade de KcsA contém quatro sítios de ligação de íons, embora seja proposto que apenas duas dessas quatro posições sejam ocupadas ao mesmo tempo. O filtro de seletividade tem cerca de 3 Å de diâmetro. embora as simulações de dinâmica molecular sugiram que o filtro é flexível. A presença de TVGYG na região do filtro de KcsA é conservada mesmo em canais eucarióticos mais complexos, tornando KcsA um sistema ideal para estudar a condutância do canal de K + entre as espécies.
Função
O canal KcsA é considerado um canal modelo porque a estrutura KcsA fornece uma estrutura para a compreensão da condução do canal K + , que tem três partes: seletividade de potássio , passagem de canal por sensibilidade de pH e inativação de canal controlada por voltagem. A permeação do íon K + ocorre na região superior do filtro de seletividade do poro, enquanto a passagem do pH aumenta a partir da protonação das hélices transmembrana no final do poro. Em pH baixo, a hélice M2 é protonada, mudando o canal iônico de conformação fechada para aberta. À medida que os íons fluem através do canal, os mecanismos de bloqueio de voltagem são pensados para induzir interações entre Glu71 e Asp80 no filtro de seletividade, o que desestabiliza a conformação condutiva e facilita a entrada em um estado não condutor de longa duração que se assemelha ao tipo C - inativação de voltagem canais dependentes .
Na conformação não condutora de KcsA em pH 7, K + está fortemente ligado aos oxigênios de coordenação do filtro de seletividade e as quatro hélices TM2 convergem perto da junção citoplasmática para bloquear a passagem de quaisquer íons de potássio. No entanto, em pH 4, KcsA sofre trocas conformacionais em escala de milissegundo, filtrando os estados de permeação e não permeação e entre as conformações abertas e fechadas das hélices M2. Embora essas mudanças conformacionais distintas ocorram em regiões separadas do canal, o comportamento molecular de cada região está ligado por interações eletrostáticas e alosteria . A dinâmica dessas configurações estereoquímicas de troca no filtro fornece a base física para condutância de K + e gating simultâneos .
Seletividade K +
A sequência TVGYG é especialmente importante para manter a especificidade de potássio de KcsA. As glicinas nesta sequência de filtro de seletividade têm ângulos diédricos que permitem que os átomos de oxigênio carbonil na estrutura da proteína do filtro apontem em uma direção, em direção aos íons ao longo do poro. As glicinas e a treonina se coordenam com o íon K + , enquanto as cadeias laterais da valina e da tirosina são direcionadas para o núcleo da proteína para impor restrições geométricas ao filtro. Como resultado, o tetrâmero KcsA abriga quatro locais de ligação de K + com espaçamento igual , com cada lado composto de uma gaiola formada por oito átomos de oxigênio que ficam nos vértices de um cubo. Os átomos de oxigênio que circundam os íons K + no filtro são arranjados como as moléculas de água que circundam os íons K + hidratados na cavidade do canal; isso sugere que a coordenação de oxigênio e os locais de ligação no filtro de seletividade estão pagando pelo custo energético da desidratação de K + . Como o íon Na + é muito pequeno para esses locais de ligação do tamanho de K + , a energia de desidratação não é compensada e, portanto, o filtro seleciona contra outros íons estranhos. Além disso, o canal KcsA é bloqueado por íons Cs + e o gating requer a presença de íons Mg 2+ .
Sensibilidade de pH
A condutância dependente do pH de KcsA indica que a abertura do canal iônico ocorre quando a proteína é exposta a um ambiente mais ácido. Estudos de NMR realizados pelo grupo Riek mostram que a sensibilidade ao pH ocorre tanto na região TM2 C-terminal da proteína quanto com os resíduos Tyr78 e Gly79 no filtro de seletividade. Há evidências que sugerem que o principal sensor de pH está no domínio citoplasmático. A troca de aminoácidos carregados negativamente por neutros tornou o canal KcsA insensível ao pH, embora não houvesse alterações de aminoácidos na região transmembrana. Além disso, entre o pH de 6 e 7, a histidina é uma das poucas cadeias laterais tituláveis das histidinas; eles estão ausentes nos segmentos transmembrana e extracelular de TM2, mas presentes no terminal C de KcsA. Isso destaca um possível mecanismo para a abertura lenta de KcsA que é particularmente sensível ao pH, especialmente porque a propagação conformacional do sinal de abertura do canal do terminal C para o filtro de seletividade pode ser importante na coordenação das mudanças estruturais necessárias para a condutância ao longo de todo o poro .
Estudos de NMR também sugerem que uma rede complexa de ligações de hidrogênio entre Tyr78, Gly79, Glu71 e Asp80 existe na região do filtro KcsA, e além disso atua como um gatilho sensível ao pH para condutância. A mutação de resíduos-chave na região, incluindo E71A, resulta em um grande custo de energia de 4 kcal mol -1 , equivalente à perda da ligação de hidrogênio entre Glu71 e Tyr78 e a ligação de hidrogênio mediada por água entre Glu71 e Asp80 em KcsA (E71A). Esses estudos destacam ainda mais o papel do controle de pH na função do canal KcsA.
Voltage Gating
Em 2006, o grupo Perozo propôs uma explicação mecanicista para os efeitos dos campos de tensão no gating KcsA. Depois de adicionar uma corrente despolarizante ao canal, ocorre a reorientação de Glu71 em direção ao poro intracelular, interrompendo assim o par carboxil-carboxilato Glu71-Asp80 que estabiliza inicialmente o filtro de seletividade. O colapso da região do filtro impede a entrada ou facilita a saída do estado inativado. Glu71, uma parte fundamental da sequência de assinatura do filtro de seletividade que é conservada entre os canais de íons K + , desempenha um papel fundamental no gating, pois sua capacidade de se reorientar na direção do campo de tensão transmembrana é capaz de fornecer uma explicação para os eventos de gating de voltagem em KcsA. A orientação dos aminoácidos na região do filtro pode desempenhar um papel fisiológico significativo na modulação dos fluxos de potássio em eucariotos e procariontes em condições de estado estacionário.
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Função
O mecanismo preciso da seletividade do canal de potássio continua a ser estudado e debatido e vários modelos são usados para descrever diferentes aspectos da seletividade. Modelos que explicam a seletividade com base no conceito de força de campo desenvolvido por George Eisenman com base na lei de Coulomb foram aplicados ao KcsA. Uma explicação alternativa para a seletividade do KcsA é baseada no modelo de ajuste fechado (também conhecido como modelo de ajuste confortável) desenvolvido por Francisco Bezanilla e Armstrong . Os átomos de oxigênio carbonil da cadeia principal que compõem o filtro de seletividade são mantidos em uma posição precisa que lhes permite substituir as moléculas de água na camada hidratada do íon de potássio , mas eles estão muito longe de um íon de sódio . Um trabalho adicional estudou as diferenças termodinâmicas na ligação de íons, considerações topológicas e o número de sítios de ligação de íons contínuos.
Além disso, uma limitação importante do estudo e das simulações da estrutura cristalina ainda precisa ser discutida: a estrutura cristalina mais bem resolvida e mais aplicada de KcsA parece ser a da forma "fechada" do canal. Isso é razoável, pois o estado fechado do canal é favorecido em pH neutro , no qual a estrutura do cristal foi resolvida por cristalografia de raios-X . No entanto, o comportamento dinâmico de KcsA torna a análise do canal difícil, pois uma estrutura cristalina inevitavelmente fornece uma imagem estática, espacial e temporalmente média de um canal. Para preencher a lacuna entre a estrutura molecular e o comportamento fisiológico, é necessária uma compreensão da dinâmica de resolução atômica dos canais de potássio.
Formulários
Devido à alta similaridade de sequência entre o poro de KcsA e outras proteínas eucarióticas do canal iônico K + , KcsA forneceu informações importantes sobre o comportamento de outras proteínas condutoras de voltagem importantes, como o Shaker derivado de drosófila e o canal de potássio hERG humano . KcsA foi usado em estudos de mutagênese para modelar as interações entre hERG e vários compostos de drogas. Esses testes podem rastrear as interações do canal de fármaco-hERG que causam a síndrome do QT longo adquirido , são essenciais para determinar a segurança cardíaca de novos medicamentos. Além disso, modelos de homologia baseados na estrutura de cristal KcsA de estado fechado foram gerados computacionalmente para construir uma representação de múltiplos estados do canal de K + cardíaco hERG . Tais modelos revelam a flexibilidade do canal hERG e podem prever de forma consistente a afinidade de ligação de um conjunto de diversos ligantes que interagem com o canal de íons. A análise das estruturas complexas de ligante-hERG pode ser usada para orientar a síntese de análogos de fármacos com responsabilidade hERG reduzida, com base na estrutura do fármaco e no potencial de acoplamento.