Ribozima em gancho - Hairpin ribozyme

Estrutura secundária de uma ribozima em gancho mínimo com substrato ligado ao RNA. Os círculos representam nucleotídeos individuais e as linhas indicam pares de base canônicos (Watson-Crick)

A ribozima em gancho é uma pequena seção de RNA que pode atuar como uma ribozima . Como a ribozima cabeça de martelo , é encontrada em satélites de RNA de vírus de plantas. Ele foi identificado pela primeira vez na cadeia menos do ARN satélite do vírus da mancha anelar do tabaco (TRSV) onde ele catalisa união (auto-clivagem e de ligação ) reacções para processar os produtos de laminagem a replicação do vírus círculo em moléculas de ARN satélite lineares e circulares. A ribozima em gancho é semelhante à ribozima de cabeça de martelo no sentido de que não requer um íon metálico para a reação.

Função biológica

A ribozima em gancho é um motivo de RNA que catalisa reações de processamento de RNA essenciais para a replicação das moléculas de RNA satélite nas quais está embutido. Essas reações são autoprocessadas, ou seja, uma molécula que reorganiza sua própria estrutura. Ambas as reações de clivagem e união de extremidades são mediadas pelo motivo da ribozima, levando a uma mistura de moléculas de RNA satélite linear e circular interconvertíveis. Essas reações são importantes para o processamento das grandes moléculas de RNA multimérico que são geradas pela replicação em círculo rolante . No final do ciclo de replicação, esses grandes intermediários de replicação de RNA satélite são processados ​​em moléculas de comprimento unitário (circular ou linear) antes de serem empacotados por vírus e transportados para outras células para novas rodadas de replicação.

Dobramento da ribozima em grampo em sua estrutura terciária nativa. A sequência da ribozima é mostrada em cinza, enquanto a sequência do substrato é vermelha clara. O local de clivagem e ligação (vermelho escuro) está entre os nucleotídeos A-1 e G + 1. Sequências importantes dentro dos loops A e B são mostradas, com pontos pretos indicando interações não Watson-Crick entre os nucleotídeos. Os dois nucleotídeos catalíticos são mostrados em verde, e o nucleotídeo crítico C25, que forma um par de bases Watson-Crick com G + 1 no local da reação, é mostrado em azul.

Versões naturais da ribozima em gancho

Na década de 1980, a ribozima em gancho foi identificada em 3 sequências de ocorrência natural e bem caracterizadas:

  • RNA satélite do vírus da mancha anelar do tabaco (sTRSV)
  • RNA satélite do vírus da chicória amarela (sCYMV)
  • RNA satélite do vírus do mosaico árabe (sARMV)

Trabalhos posteriores em 2021 revelaram quase 1000 sequências de ribozimas em grampo em organismos amplamente desconhecidos encontrados em dados de metatranscriptoma . Essas novas sequências foram hipotetizadas para ocorrer em organismos que, como aqueles que contêm as três ribozimas em gancho encontradas anteriormente, usam genomas de RNA circular de fita simples. A circularidade dos genomas foi confirmada experimentalmente, mas a natureza dos organismos ainda não foi bem estudada.

Versões artificiais da ribozima em gancho

Versões artificiais menores da ribozima em gancho foram desenvolvidas para permitir uma análise experimental mais detalhada da molécula. Esta é uma estratégia comumente usada para separar as partes de uma molécula de RNA de autoprocessamento que são essenciais para as reações de processamento de RNA das partes que desempenham funções não relacionadas. Através deste processo, um domínio catalítico mínimo de 50 nucleotídeos e um substrato de 14 nucleotídeos foram identificados. Usando essas sequências derivadas artificialmente, foi desenvolvida uma ribozima de ação trans que pode catalisar a clivagem de várias moléculas de substrato. Esta estratégia foi importante na medida em que permitiu aos investigadores (i) aplicar métodos bioquímicos para análise enzimática, (ii) conduzir experimentos para identificar elementos estruturais essenciais do complexo ribozima-substrato, e (iii) desenvolver ribozimas projetadas que foram usadas para fins biomédicos aplicações, incluindo a prevenção da replicação de vírus patogênicos e o estudo da função de genes individuais.

Química de reação

Em comum com várias outras ribozimas e ribonucleases de proteína, a reação de clivagem da ribozima em gancho gera fragmentos de RNA com terminais que consistem em um fosfato 2 ', 3'-cíclico e um grupo 5'-hidroxila. A reação de ligação parece ser uma reversão simples da clivagem, ou seja, união covalente de fragmentos de RNA terminando com um 2 ', 3'-fosfato cíclico e um grupo 5'-hidroxil para gerar a ligação 3'-5' fosfodiéster comum usada em ambos RNA e DNA.

Estudos dessa reação em múltiplas ribozimas serviram para estabelecer que a química da reação (mecanismo catalítico) é uma propriedade endógena da própria molécula de RNA e não é mediada por íons metálicos, como é verdade para algumas enzimas protéicas e algumas outras ribozimas. Além disso, a atividade de clivagem ainda é observada quando o Mg 2+ é substituído por [Co (NH 3 ) 6 ] 3+ . O Co 3+ liga o NH 3 tão fortemente na solução que o NH 3 não se dissocia em nenhuma extensão apreciável e, portanto, não se torna protonado. Isso sugere que não há transferência de prótons catalisada por metal ou coordenação direta com o RNA, mas, em vez disso, os metais são necessários apenas para o dobramento. Além disso, em estruturas cristalinas de um complexo de inibidor de ribozima e um mimetizador de estado de transição, foi mostrado que a arquitetura tridimensional separa A-1 e G + 1, posicionando o 2'-OH de A-1 para um ataque nucleofílico em linha na ligação de fosfato cindível. Além disso, G8, A38 e A9 têm sido sugeridos para desempenhar papéis na catálise, desprotonando o 2'-OH de A-1, estabilizando a carga negativa em desenvolvimento dos oxigênio de fosfato pentacoordenado e protonando o grupo de saída 5'-O de G + 1.

Estrutura

Uma representação da estrutura 3D da ribozima em gancho.

O complexo ribozima-substrato em gancho mínimo se dobra em uma estrutura secundária que inclui dois domínios, cada um consistindo de duas hélices emparelhadas de base curta separadas por uma alça interna. O domínio A (hélice 1 - alça A - hélice 2) contém o substrato e a região de reconhecimento do substrato primário da ribozima. O domínio B (hélice 3 - loop B - hélice 4) é maior e contém os determinantes catalíticos primários da ribozima. Os dois domínios são unidos covalentemente por meio de uma ligação fosfodiéster que conecta a hélice 2 à hélice 3. Esses domínios devem interagir um com o outro para que a catálise ocorra.

Quando o complexo ribozima-substrato mínimo é permitido dobrar sob condições de baixa força iônica , os dois domínios empilham um sobre o outro, formando uma estrutura estendida inativa que se assemelha a um grampo de cabelo. Para que a catálise ocorra, os dois domínios ficam paralelos um ao outro em uma dobra que se assemelha a um clipe de papel. Em várias publicações, este RNA foi denominado ribozima "clipe" ou "grampo de cabelo". Apesar de o primeiro nome ter se mostrado mais preciso, o último tornou-se a nomenclatura comumente aceita. No laboratório, uma interação funcional entre os dois domínios é promovida pela adição de cátions , cuja carga positiva é suficiente para superar a repulsão eletrostática do backbone de RNA carregado negativamente. Na natureza, a associação dos dois domínios é auxiliada por meio de uma combinação de íons metálicos (incluindo Mg 2+ ) e a presença de dois domínios helicoidais adicionais que não estão presentes no complexo ribozima-substrato mínimo, mas servem para promover o dobramento tridimensional adequado . Esses domínios adicionais empilham as hélices 2 e 3, promovendo assim a associação dos dois domínios funcionais através do que é denominado uma junção helicoidal de quatro vias.

A estrutura e atividade da ribozima em gancho foram exploradas usando uma ampla gama de métodos experimentais complementares, incluindo substituição de nucleotídeos, substituição de grupo funcional, seleção combinatória, espectroscopia de fluorescência , reticulação covalente , análise de NMR e cristalografia de raios-x . Esses estudos foram facilitados pela capacidade do complexo funcional de se automontar a partir de segmentos feitos pela síntese química de RNA em fase sólida , permitindo a incorporação de uma ampla variedade de nucleotídeos modificados que não são encontrados naturalmente no RNA. Juntos, os resultados desses experimentos apresentam uma imagem altamente congruente do ciclo catalítico , ou seja, como a ribozima em gancho liga seu substrato, se dobra em uma estrutura tridimensional específica, catalisa a reação e libera o (s) produto (s) da reação.

Clivagem de RNA direcionada e atividade antiviral

As ribozimas em gancho foram modificadas de tal forma que podem ser usadas para direcionar a clivagem de outras moléculas de RNA. Isso é possível porque muito da especificidade do substrato da ribozima em gancho resulta do emparelhamento de bases Watson-Crick simples dentro das hélices 1 e 2.

Uma área de interesse particular tem sido o desenvolvimento de ribozimas em gancho para uso terapêutico potencial, por exemplo, evitando a replicação de vírus patogênicos. Ribozimas em gancho de cabelo antivirais foram geradas e expressas em células de mamíferos, e células que expressam diferentes ribozimas projetadas mostraram ser resistentes à infecção por HIV-1 , hepatite B e vírus Sindbis .

Referências

Leitura adicional

links externos