Ribozima - Ribozyme

Estrutura 3D de uma ribozima de cabeça de martelo

Ribozimas ( ácido nucleico ribonucleico e enzimas ) são moléculas de RNA que têm a capacidade de catalisar reações bioquímicas específicas, incluindo splicing de RNA na expressão gênica , semelhante à ação de enzimas protéicas . A descoberta das ribozimas em 1982 demonstrou que o RNA pode ser tanto material genético (como o DNA ) quanto um catalisador biológico (como enzimas protéicas) e contribuiu para a hipótese do mundo do RNA , que sugere que o RNA pode ter sido importante na evolução da sistemas replicantes. As atividades mais comuns das ribozimas naturais ou evoluídas in vitro são a clivagem ou ligação de RNA e DNA e a formação de ligações peptídicas. Dentro do ribossomo , as ribozimas funcionam como parte da grande subunidade do RNA ribossômico para ligar os aminoácidos durante a síntese de proteínas . Eles também participam de uma variedade de reações de processamento de RNA , incluindo splicing de RNA , replicação viral e biossíntese de RNA de transferência . Exemplos de ribozimas incluem a ribozima cabeça de martelo , a ribozima VS , Leadzyme e a ribozima em gancho .

Os investigadores que estudam a origem da vida produziram ribozimas em laboratório que são capazes de catalisar sua própria síntese a partir de monômeros ativados sob condições muito específicas, como uma ribozima de RNA polimerase . A mutagênese e a seleção foram realizadas resultando no isolamento de variantes melhoradas da ribozima da polimerase "Round-18" de 2001. "B6.61" é capaz de adicionar até 20 nucleotídeos a um modelo de iniciador em 24 horas, até que se decomponha por clivagem de suas ligações fosfodiéster. A ribozima "tC19Z" pode adicionar até 95 nucleotídeos com uma fidelidade de 0,0083 mutações / nucleotídeo.

Têm sido feitas tentativas para desenvolver ribozimas como agentes terapêuticos, como enzimas que têm como alvo sequências de ARN definidas para clivagem, como biossensores e para aplicações em genómica funcional e descoberta de genes.

Descoberta

Esquema mostrando a clivagem do RNA por ribozima.

Antes da descoberta das ribozimas, as enzimas , que são definidas como proteínas catalíticas , eram os únicos catalisadores biológicos conhecidos . Em 1967, Carl Woese , Francis Crick e Leslie Orgel foram os primeiros a sugerir que o RNA poderia atuar como um catalisador. Essa ideia foi baseada na descoberta de que o RNA pode formar estruturas secundárias complexas . Essas ribozimas foram encontradas no íntron de um transcrito de RNA, que se retirou do transcrito, bem como no componente de RNA do complexo RNase P, que está envolvido na maturação de pré- tRNAs . Em 1989, Thomas R. Cech e Sidney Altman compartilharam o Prêmio Nobel de Química por sua "descoberta das propriedades catalíticas do RNA". O termo ribozima foi introduzido pela primeira vez por Kelly Kruger et al. em 1982 em um artigo publicado na Cell .

Era uma crença firmemente estabelecida na biologia que a catálise era reservada para proteínas. No entanto, a ideia da catálise de RNA é motivada em parte pela velha questão sobre a origem da vida: o que vem primeiro, as enzimas que fazem o trabalho da célula ou os ácidos nucléicos que carregam as informações necessárias para produzir as enzimas? O conceito de "ácidos ribonucléicos como catalisadores" contorna esse problema. O RNA, em essência, pode ser a galinha e o ovo.

Na década de 1980, Thomas Cech, da Universidade do Colorado em Boulder , estava estudando a excisão de íntrons em um gene de RNA ribossômico em Tetrahymena thermophila . Ao tentar purificar a enzima responsável pela reação de splicing, ele descobriu que o íntron poderia ser splicing na ausência de qualquer extrato celular adicionado. Por mais que tentassem, Cech e seus colegas não conseguiram identificar nenhuma proteína associada à reação de splicing. Depois de muito trabalho, Cech propôs que a porção da sequência do íntron do RNA poderia quebrar e reformar as ligações fosfodiéster . Quase ao mesmo tempo, Sidney Altman, professor da Universidade de Yale , estava estudando a maneira como as moléculas de tRNA são processadas na célula quando ele e seus colegas isolaram uma enzima chamada RNase-P , que é responsável pela conversão de um tRNA precursor em tRNA ativo. Para sua surpresa, eles descobriram que a RNase-P continha RNA além da proteína e que o RNA era um componente essencial da enzima ativa. Essa era uma ideia tão estranha que eles tiveram dificuldade em publicar suas descobertas. No ano seguinte, Altman demonstrou que o RNA pode atuar como um catalisador, mostrando que a subunidade de RNA RNase-P poderia catalisar a clivagem do tRNA precursor em tRNA ativo na ausência de qualquer componente de proteína.

Desde a descoberta de Cech e Altman, outros pesquisadores descobriram outros exemplos de RNA autoclivável ou moléculas de RNA catalítico. Muitas ribozimas têm um centro ativo em forma de grampo ou de martelo e uma estrutura secundária única que permite a clivagem de outras moléculas de RNA em sequências específicas. Agora é possível fazer ribozimas que irão clivar especificamente qualquer molécula de RNA. Esses catalisadores de RNA podem ter aplicações farmacêuticas. Por exemplo, uma ribozima foi projetada para clivar o RNA do HIV. Se tal ribozima fosse produzida por uma célula, todas as partículas virais recebidas teriam seu genoma de RNA clivado pela ribozima, o que evitaria a infecção.

Estrutura e mecanismo

Apesar de ter apenas quatro opções para cada unidade monomérica (nucleotídeos), em comparação com as cadeias laterais de 20 aminoácidos encontradas nas proteínas, as ribozimas têm estruturas e mecanismos diversos. Em muitos casos, eles são capazes de imitar o mecanismo usado por suas contrapartes de proteínas. Por exemplo, em RNAs de ribozima autoclaváveis, uma reação SN2 em linha é realizada usando o grupo hidroxila 2 'como um nucleófilo atacando o fosfato em ponte e fazendo com que o oxigênio 5' da base N + 1 atue como um grupo abandonante. Em comparação, a RNase A, uma proteína que catalisa a mesma reação, usa uma coordenação de histidina e lisina para atuar como uma base para atacar a estrutura do fosfato.

Como muitas enzimas proteicas, a ligação ao metal também é crítica para o funcionamento de muitas ribozimas. Freqüentemente, essas interações usam a estrutura de fosfato e a base do nucleotídeo, causando mudanças conformacionais drásticas. Existem duas classes de mecanismo para a clivagem da estrutura fosfodiéster na presença de metal. No primeiro mecanismo, o grupo 2'-OH interno ataca o centro de fósforo em um mecanismo SN 2 . Os íons metálicos promovem essa reação coordenando primeiro o oxigênio fosfato e, posteriormente, estabilizando o oxiânion. O segundo mecanismo também segue um deslocamento SN 2 , mas o nucleófilo vem da água ou de grupos hidroxila exógenos, em vez do próprio RNA. A menor ribozima é UUU, que pode promover a clivagem entre G e A do tetranucleotídeo GAAA através do primeiro mecanismo na presença de Mn 2+ . A razão pela qual este trinucleotídeo, em vez do tetrâmero complementar, catalisa essa reação pode ser porque o par UUU-AAA é o trinucleotídeo mais fraco e flexível entre as 64 conformações, que fornece o local de ligação para Mn 2+ .

A transferência de fosforil também pode ser catalisada sem íons metálicos. Por exemplo, ribonuclease A pancreática e ribozimas do vírus da hepatite delta (HDV) podem catalisar a clivagem do esqueleto do RNA através da catálise ácido-base sem íons metálicos. A ribozima em gancho também pode catalisar a autoclivagem do RNA sem íons metálicos, mas o mecanismo ainda não está claro.

A ribozima também pode catalisar a formação de ligação peptídica entre os aminoácidos adjacentes, diminuindo a entropia de ativação.

Imagens da estrutura da ribozima
Imagem mostrando a diversidade das estruturas das ribozimas. Da esquerda para a direita: leadzyme, hammerhead ribozme, twister ribozme

Atividades

Um ribossomo é uma máquina biológica que utiliza uma ribozima para traduzir RNA em proteínas

Embora as ribozimas sejam bastante raras na maioria das células, suas funções às vezes são essenciais para a vida. Por exemplo, a parte funcional do ribossomo , a máquina biológica que traduz o RNA em proteínas, é fundamentalmente uma ribozima, composta de motivos estruturais terciários de RNA que muitas vezes são coordenados com íons metálicos, como Mg 2+, como cofatores . Em um sistema modelo, não há necessidade de cátions divalentes em um RNA de cinco nucleotídeos que catalisa a trans - fenilalanação de um substrato de quatro nucleotídeos com 3 pares de bases complementares ao catalisador, onde o catalisador / substrato foi criado por truncamento da ribozima C3 .

As ribozimas mais bem estudadas são provavelmente aquelas que se cortam a si mesmas ou a outros RNAs, como na descoberta original de Cech e Altman. No entanto, as ribozimas podem ser projetadas para catalisar uma série de reações (veja abaixo), muitas das quais podem ocorrer na vida, mas não foram descobertas nas células.

O RNA pode catalisar o dobramento da conformação da proteína patológica de um príon de uma maneira semelhante à de uma chaperonina .

Ribozimas e a origem da vida

O RNA também pode atuar como uma molécula hereditária, o que encorajou Walter Gilbert a propor que, no passado distante, a célula usava o RNA tanto como material genético quanto como molécula estrutural e catalítica em vez de dividir essas funções entre DNA e proteína como são hoje; esta hipótese é conhecida como a " hipótese do mundo do RNA " da origem da vida . Uma vez que os nucleotídeos e o RNA e, portanto, as ribozimas podem surgir por produtos químicos inorgânicos, eles são candidatos às primeiras enzimas e, de fato, aos primeiros "replicadores", isto é, macromoléculas contendo informações que se replicam. Um exemplo de ribozima autorreplicante que liga dois substratos para gerar uma cópia exata de si mesma foi descrito em 2002. A descoberta da atividade catalítica do RNA resolveu o paradoxo "ovo e galinha" da origem da vida, resolvendo o problema da origem do dogma central de peptídeos e ácidos nucléicos. De acordo com esse cenário, nos primeiros anos de vida, toda a atividade enzimática e a codificação da informação genética eram feitas por uma molécula, o RNA.

Ribozimas artificiais

Desde a descoberta das ribozimas existentes em organismos vivos, tem havido interesse no estudo de novas ribozimas sintéticas feitas em laboratório. Por exemplo, RNAs autocliváveis ​​produzidos artificialmente que têm boa atividade enzimática foram produzidos. Tang e Breaker isolaram RNAs autocliváveis ​​por seleção in vitro de RNAs originários de RNAs de sequência aleatória. Algumas das ribozimas sintéticas que foram produzidas tinham estruturas novas, enquanto outras eram semelhantes à ribozima cabeça de martelo que ocorre naturalmente. Em 2015, pesquisadores da Northwestern University e da University of Illinois at Chicago desenvolveram um ribossomo amarrado que funciona quase tão bem quanto o componente celular autêntico que produz todas as proteínas e enzimas dentro da célula. Chamado de Ribossomo-T , ou Ribo-T, o ribossomo artificial foi criado por Michael Jewett e Alexander Mankin. As técnicas usadas para criar ribozimas artificiais envolvem evolução direcionada. Esta abordagem tira proveito da natureza dupla do RNA como um catalisador e um polímero informativo, tornando mais fácil para um investigador produzir vastas populações de catalisadores de RNA usando enzimas polimerase . As ribozimas são mutadas por transcrição reversa delas com transcriptase reversa em vários cDNA e amplificadas com PCR propenso a erros . Os parâmetros de seleção nesses experimentos costumam ser diferentes. Uma abordagem para selecionar uma ribozima ligase envolve o uso de marcadores de biotina , que são covalentemente ligados ao substrato. Se uma molécula possui a atividade ligase desejada , uma matriz de estreptavidina pode ser usada para recuperar as moléculas ativas.

Lincoln e Joyce desenvolveram um sistema enzimático de RNA capaz de auto-replicação em cerca de uma hora. Ao utilizar a competição molecular ( evolução in vitro ) de uma mistura de RNA candidata, surgiu um par de ribozimas, em que cada uma sintetiza a outra ao se juntar a oligonucleotídeos sintéticos, sem a presença de proteína.

Embora não sejam verdadeiros catalisadores, a criação de riboswitches autocliváveis ​​artificiais, denominados aptazimas, também tem sido uma área ativa de pesquisa. Riboswitches são motivos reguladores de RNA que mudam sua estrutura em resposta a uma pequena molécula ligante para regular a tradução. Embora existam muitos riboswitches naturais conhecidos que se ligam a uma ampla gama de metabólitos e outras pequenas moléculas orgânicas, apenas uma ribozima com base em um riboswitch foi descrita, glmS . Os primeiros trabalhos na caracterização de riboswitches autoclaváveis ​​se concentraram no uso de teofilina como ligante. Nestes estudos, forma-se um grampo de ARN que bloqueia o local de ligação ao ribossoma , inibindo assim a tradução. Na presença do ligante , nesses casos a teofilina, a região reguladora do RNA é clivada, permitindo que o ribossomo se ligue e traduza o gene alvo. Muito desse trabalho de engenharia de RNA foi baseado em design racional e estruturas de RNA previamente determinadas, em vez de evolução direcionada como nos exemplos acima. Trabalhos mais recentes ampliaram os ligantes usados ​​em riboswitches de ribozima para incluir pirofosfato de timina (2). A classificação de células ativadas por fluorescência também tem sido usada para desenvolver aptazimas.

Ribozima RNA polimerase

Acredita-se que a vida moderna, baseada em grande parte no DNA como material genético, tenha descendido de organismos baseados em RNA em um mundo de RNA anterior . A vida do RNA teria dependido de uma ribozima de RNA polimerase dependente de RNA para copiar moléculas de RNA funcionais, incluindo a cópia da própria polimerase. Tjhung et al. obtiveram uma ribozima de RNA polimerase por evolução in vitro que possui um nível de atividade sem precedentes na cópia de moléculas complexas de RNA. No entanto, essa ribozima é incapaz de se copiar e seus produtos de RNA têm uma alta taxa de mutação . No entanto, continuam a ser feitos progressos no sentido de obter, por evolução in vitro , uma ribozima de ARN polimerase auto-reproduzível precisa e eficiente, a fim de melhorar a compreensão da evolução inicial da vida.

Samanta e Joyce descobriram que uma ribozima de RNA polimerase altamente evoluída era capaz de funcionar como uma transcriptase reversa , ou seja, pode sintetizar uma cópia de DNA usando um molde de RNA. Tal atividade é considerada crucial para a transição de genomas de RNA para DNA durante o início da história da vida na Terra. A capacidade de transcrição reversa pode ter surgido como uma função secundária de uma ribozima da polimerase de RNA dependente de RNA precoce.

Formulários

Ribozimas têm sido propostas e desenvolvidas para o tratamento de doenças por meio de terapia gênica (3). Um grande desafio do uso de enzimas baseadas em RNA como um agente terapêutico é a meia-vida curta das moléculas de RNA catalíticas no corpo. Para combater isso, a posição 2 'na ribose é modificada para melhorar a estabilidade do RNA. Uma área da terapia genética com ribozimas tem sido a inibição de vírus baseados em RNA.

Um tipo de ribozima sintética dirigida contra o RNA do HIV, chamado gene shears, foi desenvolvido e entrou em testes clínicos para infecção pelo HIV.

Da mesma forma, as ribozimas foram projetadas para atingir o RNA do vírus da hepatite C, coronavírus SARS (SARS-CoV), adenovírus e RNA do vírus influenza A e B. A ribozima é capaz de clivar as regiões conservadas do genoma do vírus, o que demonstrou reduzir o vírus em culturas de células de mamíferos. Apesar dos esforços dos pesquisadores, esses projetos permaneceram na fase pré-clínica.

Ribozimas conhecidas

Classes de ribozimas de ocorrência natural bem validadas:

Veja também

Notas e referências

Leitura adicional

links externos