Mapa de restrição - Restriction map
Um mapa de restrição é um mapa de locais de restrição conhecidos dentro de uma sequência de DNA . O mapeamento de restrição requer o uso de enzimas de restrição . Na biologia molecular , os mapas de restrição são usados como referência para manipular plasmídeos ou outros pedaços relativamente curtos de DNA e, às vezes, para DNA genômico mais longo. Existem outras maneiras de mapear recursos no DNA para moléculas de DNA de comprimento mais longo, como o mapeamento por transdução .
Uma abordagem na construção de um mapa de restrição de uma molécula de DNA é sequenciar a molécula inteira e executar a sequência por meio de um programa de computador que encontrará os locais de reconhecimento que estão presentes para cada enzima de restrição conhecida.
Antes de o sequenciamento ser automatizado, teria sido proibitivamente caro sequenciar uma fita inteira de DNA. Para encontrar as posições relativas dos locais de restrição em um plasmídeo, é usada uma técnica envolvendo digestão de restrição simples e dupla. Com base nos tamanhos dos fragmentos de DNA resultantes, as posições dos locais podem ser inferidas. O mapeamento de restrição é uma técnica muito útil quando usada para determinar a orientação de uma inserção em um vetor de clonagem, mapeando a posição de um sítio de restrição fora do centro na inserção.
Método
O procedimento experimental requer primeiro uma alíquota de DNA de plasmídeo purificado (ver apêndice) para cada digestão a ser executada. A digestão é então realizada com cada enzima (s) escolhida (s). As amostras resultantes são subsequentemente executadas em gel de eletroforese , normalmente em gel de agarose .
A primeira etapa após a conclusão da eletroforese é somar os tamanhos dos fragmentos em cada pista. A soma dos fragmentos individuais deve ser igual ao tamanho do fragmento original, e os fragmentos de cada digest também devem ser do mesmo tamanho que os outros. Se os tamanhos dos fragmentos não forem somados corretamente, há dois problemas prováveis. Em um caso, alguns dos fragmentos menores podem ter escorrido do final do gel. Isso ocorre freqüentemente se o gel for executado por muito tempo. Uma segunda possível fonte de erro é que o gel não era denso o suficiente e, portanto, não foi capaz de resolver fragmentos próximos em tamanho. Isso leva à falta de separação de fragmentos de tamanho próximo. Se todos os digeridos produzirem fragmentos que se somam, pode-se inferir a posição dos sítios REN (endonuclease de restrição), colocando-os em pontos no fragmento de DNA original que satisfaçam os tamanhos dos fragmentos produzidos por todos os três digeridos.
Consulte também enzimas de restrição para obter mais detalhes sobre as enzimas exploradas nesta técnica.
Desnaturação e renaturação rápidas de uma preparação de DNA em bruto por lise alcalina das células e subsequente neutralização
Nesta técnica, as células são lisadas em condições alcalinas. O DNA da mistura é desnaturado (as fitas são separadas) ao romper as ligações de hidrogênio entre as duas fitas. O grande DNA genômico está sujeito a emaranhado e permanece desnaturado quando o pH é reduzido durante a neutralização. Em outras palavras, os fios se juntam de maneira desordenada, em pares de base aleatoriamente. As fitas circulares dos plasmídeos superenrolados ficarão relativamente alinhadas e renaturarão corretamente. Portanto, o DNA genômico formará um agregado insolúvel e os plasmídeos superenrolados serão deixados em solução. Isso pode ser seguido pela extração de fenol para remover proteínas e outras moléculas. Em seguida, o DNA pode ser submetido à precipitação com etanol para concentrar a amostra.
Veja também
- Vector NTI , software de bioinformática usado entre outras coisas para prever locais de restrição em um vetor de DNA
- RFLP , método usado para diferenciar genomas extremamente semelhantes, entre outras coisas