RPE65 - RPE65
A proteína de 65 kDa específica do epitélio pigmentar da retina, também conhecida como isomerohidrolase retinóide, é uma enzima do ciclo visual dos vertebrados que é codificada em humanos pelo gene RPE65 . O RPE65 é expresso no epitélio pigmentar da retina (RPE, uma camada de células epiteliais que nutrem as células fotorreceptoras ) e é responsável pela conversão de todos os ésteres de retinil trans em 11-cis- retinol durante a fototransdução . O 11-cis-retinol é então usado na regeneração visual do pigmento em células fotorreceptoras . RPE65 pertence à família de enzimas carotenóides oxigenase .
Função
RPE65 é uma enzima crítica no ciclo visual dos vertebrados encontrada no epitélio pigmentado da retina. Também é encontrado em bastonetes e cones. A fotoisomerização de 11-cis-retinal para todo-trans-retinal inicia a via de fototransdução através da qual o cérebro detecta a luz. O all-trans-retinol não é fotoativo e, portanto, deve ser reconvertido em 11-cis-retinal antes de poder se recombinar com a opsina para formar um pigmento visual ativo. RPE65 reverte a fotoisomerização convertendo um éster trans-retinílico em 11-cis-retinol. Mais comumente, o substrato éster é o palmitato de retinila . As outras enzimas do ciclo visual completam as reações necessárias para oxidar e esterificar todo-trans-retinol em um éster retinílico (substrato de RPE65) e para oxidar 11-cis-retinol em 11-cis-retinal (o componente de pigmento visual fotoativo necessário) .
RPE65 também é referido como retinol isomerase ou retinóide isomerase, devido a debates anteriores sobre o substrato da enzima e se ela estava envolvida na hidrólise do éster .
Estrutura
RPE65 é um dímero de duas subunidades simétricas e enzimaticamente independentes. O sítio ativo de cada subunidade tem uma estrutura de hélice beta de sete lâminas com quatro histidinas que contêm um cofator de ferro (II) . Este motivo estrutural é comum entre os membros estudados da família de enzimas carotenóides oxigenase . RPE65 está fortemente associado à membrana do retículo endoplasmático liso nas células RPE.
Estrutura ativa do site
O sítio ativo de cada sítio ativo RPE65 contém um cofator Fe (II) ligado por quatro histidinas (His 180 , His 241 , His 313 e His 527 ), cada um contribuído por uma pá separada na estrutura da hélice beta. Três das quatro histidinas são coordenadas aos resíduos de ácido glutâmico próximos (Glu 148 , Glu 417 e Glu 469 ), que se acredita ajudar a posicionar as histidinas para ligar o cofator de ferro em uma geometria octaédrica . Phe 103 , Thr 147 e Glu 148 circundam o sítio ativo onde ajudam a estabilizar o carbocátion intermediário e aumentar a estereosseletividade de RPE65 para 11-cis-retinol sobre 13-cis-retinol.
Os reagentes e produtos provavelmente entram e saem do sítio ativo através de um túnel hidrofóbico que se pensa abrir na membrana lipídica para absorção direta do substrato lipídico. Um segundo túnel menor também atinge o local ativo e pode servir como via para a água, mas é muito estreito para transportar os reagentes e produtos retinóides.
Interações de membrana
RPE65 está fortemente associado à membrana do sER. sER é anormalmente abundante em células RPE devido ao seu papel no processamento de retinóides lipídicos . Estudos estruturais indicam que RPE65 está parcialmente embutido na membrana sER por meio de interações entre sua face hidrofóbica e o interior da membrana lipídica . Isso é apoiado pela necessidade de detergente para solubilizar RPE65. Uma parte importante da face hidrofóbica de RPE65, resíduos 109-126, forma uma hélice alfa anfipática que provavelmente contribui para a afinidade de membrana da proteína. Além disso, Cys 112 é palmitoilado em RPE65 nativo, apoiando ainda mais a teoria de que a face hidrofóbica de RPE65 está embutida na membrana.
A face hidrofóbica contém a entrada para o grande túnel que leva ao sítio ativo da enzima . A presença deste canal na face hidrofóbica combinada com a capacidade demonstrada de RPE65 de absorver a direção do substrato da bicamada lipídica é consistente com RPE65 sendo parcialmente incorporado na membrana.
Conservação
RPE65 foi isolado de uma ampla gama de vertebrados, incluindo peixes-zebra, galinhas, ratos, sapos e humanos. Sua estrutura é altamente conservada entre as espécies, particularmente na hélice beta e provavelmente nas regiões ligadas à membrana. As sequências de aminoácidos de RPE65 humano e bovino diferem em menos de 1%. Os resíduos de histidina da estrutura da hélice beta e o cofator de ferro ligado (II) são 100% conservados entre os ortólogos RPE65 estudados e outros membros da família da oxigenase carotenóide .
Solúvel RPE65 (sRPE65)
Anteriormente, foi proposto que RPE65 existe em duas formas interconvertidas: mRPE65 ligado à membrana e sRPE65 solúvel. Esta teoria sugeriu que a conversão reversível de sRPE65 em mRPE65 por palmitoilação em Cys 231 , Cys 329 e Cys 330 desempenhou um papel na regulação do ciclo retinóide e dotando mRPE65 com sua afinidade de membrana. No entanto, estudos cristalográficos de RPE65 demonstraram que esses resíduos não são palmitoilados nem voltados para a superfície. Novos estudos também não conseguiram confirmar a presença de RPE solúvel em abundância65. Assim, essa teoria foi amplamente abandonada.
Mecanismo
RPE65 catalisa a conversão de éster all-trans-retinil em 11-cis-retinol por meio de uma clivagem de ligação S N 1 O-alquil proposta . A combinação de RPE65 de uma clivagem de O-alquil éster, isomerização geométrica e adição de água é atualmente considerada única na biologia. No entanto, as reações de clivagem de O-alquil éster com intermediários carbocátion estabilizados de forma semelhante são usadas por químicos orgânicos.
Clivagem de O-Alquil
A clivagem O-alquil da ligação éster, auxiliada por um cofator Fe (II), cria um intermediário de carbocátion que é estabilizado pela cadeia de polieno conjugada. A deslocalização do carbocátion reduz a ordem de ligação da cadeia de polieno, reduzindo assim a energia de ativação da isomerização trans para cis. Além disso, Phe 103 e Thr 178 estabilizam o carbocátion isomerizado e são considerados responsáveis pela estereosseletividade da enzima. Após a isomerização, um ataque nucleofílico pela água em C15 restaura a conjugação da cadeia de polieno e completa a clivagem da ligação éster.
Mecanismo S N 2 alternativo
Quase todas as outras reações de hidrólise de ésteres bioquímicos ocorrem por meio da reação S N 2 no carbono acílico . No entanto, estudos de marcação de isótopos demonstraram que o oxigênio no produto 11-cis-retinol final de RPE65 se origina do solvente em vez do éster reagente, apoiando o mecanismo de clivagem de O-alquil. Além disso, um mecanismo de reação de hidrólise do éster S N 2 dependeria de um ataque S N 2 desfavorável em separado no C11 rico em elétrons por algum nucleófilo - mais provavelmente um resíduo de cistina - para completar a porção de isomerização da reação. Não é apenas o ataque nucleofílico de um alceno energeticamente desfavorável, mas a região do sítio ativo carece de resíduos de cistina para atuar como o nucleófilo.
Significado clínico
Mutações neste gene foram associadas à amaurose congênita de Leber tipo 2 (LCA2) e retinite pigmentosa (RP). Mutações RPE65 são as mutações mais comumente detectadas em pacientes com LCA na Dinamarca. A grande maioria das mutações RPE65 em pacientes com LCA2 e RP ocorre no regime de hélice beta e acredita-se que inibe o dobramento adequado de proteínas e a ligação do cofator de ferro. Os locais de mutação de hélice particularmente comuns são Tyr 368 e His 182 . A substituição em Arg 91 também é comum e demonstrou afetar as interações da membrana RPE65 e a absorção do substrato.
Embora a perda completa da função esteja associada a doenças como LCA e RP, a inibição parcial de RPE65 foi proposta como um tratamento para a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). All-trans-retinylamine (Ret-NH2) e emixustat ambos têm sido mostrados para inibir competitivamente RPE65. O Emixustat está atualmente passando por testes clínicos de fase 3 da FDA como uma terapia para a DMRI.
O trabalho de Jean Bennett e Katherine A. High com a mutação RPE65 reverteu uma forma hereditária de cegueira. Eles receberam a primeira aprovação do FDA de uma terapia genética para uma doença genética, que é chamada de Voretigene neparvovec . Por suas realizações científicas, Jean Bennett e Katherine A. High foram nomeados como um dos três finalistas em 2018 para o prêmio Lorraine Cross de US $ 1 milhão da Sanford Health por inovação em ciência e medicina.
Veja também
Referências
Leitura adicional
- Estrutura e função da proteína
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