Lisado de amebócito Limulus - Limulus amebocyte lysate
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O lisado de amebócito Limulus ( LAL ) é um extrato aquoso de células sanguíneas ( amebócitos ) do caranguejo ferradura do Atlântico Limulus polyphemus . O LAL reage com o lipopolissacarídeo de endotoxina bacteriana (LPS), que é um componente da membrana das bactérias gram-negativas . Essa reação é a base do teste LAL , amplamente utilizado para a detecção e quantificação de endotoxinas bacterianas .
Na Ásia, um teste semelhante de lisado de amebócito de Tachypleus ( TAL ) baseado nos caranguejos-ferradura locais Tachypleus gigas ou Tachypleus tridentatus é ocasionalmente usado. O ensaio do fator C recombinante (rFC) é uma substituição de LAL / TAL com base em uma reação semelhante.
Fundo
Fred Bang relatou em 1956 que as bactérias gram-negativas, mesmo se mortas, farão com que o sangue do caranguejo-ferradura se transforme em uma massa semissólida. Posteriormente, foi reconhecido que as células sanguíneas do animal, células móveis chamadas amebócitos , contêm grânulos com um fator de coagulação conhecido como coagulogênio ; este é liberado fora da célula quando a endotoxina bacteriana é encontrada. Acredita-se que a coagulação (gelificação) resultante contenha infecções bacterianas no sistema circulatório semifechado do animal . A análise moderna do lisado levou à compreensão desse sistema de cascata, com várias enzimas trabalhando em sequência para produzir o gel. O ponto de entrada da coagulação induzida por endotoxina é o fator de coagulação Limulus C.
Em 1977, a Food and Drug Administration (FDA) dos EUA aprovou o LAL para testar drogas, produtos e dispositivos que entram em contato com o sangue. Antes dessa data, um teste muito mais lento e caro em coelhos tinha sido usado para esse fim.
Caranguejos-ferradura são coletados e o sangue é removido do pericárdio do caranguejo-ferradura ; os caranguejos são então devolvidos à água. Os fabricantes de LAL mediram taxas de mortalidade de 3% em caranguejos sangrados; entretanto, estudos recentes indicam que esse número pode estar próximo de 15% ou até 30%. As células sanguíneas são separadas do soro por centrifugação e, em seguida, colocadas em água destilada, o que as faz inchar e estourar ("lise"). Isso libera os produtos químicos de dentro da célula (o "lisado"), que é então purificado e liofilizado . Para testar a presença de endotoxinas em uma amostra, ela é misturada com lisado e água; endotoxinas estão presentes se ocorrer coagulação.
O teste LAL
Existem três metodologias básicas: gel-coágulo, turbidimétrico e cromogênico. A principal aplicação do LAL é o teste de produtos farmacêuticos parenterais e dispositivos médicos que entram em contato com sangue ou líquido cefalorraquidiano . Nos Estados Unidos, o FDA publicou uma diretriz para validação do teste LAL como um teste de endotoxina para tais produtos.
A cascata LAL também é desencadeada por (1,3) -β-D- glucana , por meio de um Fator G. diferente. Ambas as endotoxinas bacterianas e (1,3) -β-D-glucana são consideradas padrões moleculares associados a patógenos , ou PAMPs , substâncias que provocam respostas inflamatórias em mamíferos .
Superando a inibição e o aprimoramento
Um dos aspectos mais demorados do teste de endotoxina usando LAL é o pré-tratamento de amostras para superar a inibição do ensaio que pode interferir com o teste de LAL de forma que a recuperação da endotoxina seja afetada. Se o produto que está sendo testado fizer com que a recuperação de endotoxina seja menor do que o esperado, o produto é inibitório para o teste de LAL. Produtos que causam valores maiores do que os esperados estão melhorando. Superar as propriedades de inibição e aprimoramento de um produto é exigido pelo FDA como parte da validação do teste LAL para uso no teste de liberação final de injetáveis e dispositivos médicos. A recuperação adequada de endotoxinas deve ser comprovada antes que o LAL possa ser usado para liberar o produto.
Alternativas
Fator C recombinante
O teste LAL é uma importante fonte de dependência de produtos de origem animal na indústria biomédica e um desafio para os Três Rs da ciência em relação ao uso de animais em testes. Com relatos de taxas de mortalidade mais altas do que o previsto, tem sido considerado mais ético conceber alternativas para o teste. A ideia de que se afastar da LAL para reduzir o uso de caranguejos-ferradura do Atlântico ajudará os esforços de conservação deve ser avaliada com cuidado, já que a mudança para a RFC poderia produzir efeitos contraproducentes, colocando em risco os esforços de conservação que muitos lutaram para implementar. Desde 2003, um substituto de proteína recombinante para uso no teste LAL está disponível comercialmente. Chamado de ensaio do fator C recombinante (rFC), ele é baseado na mesma proteína do fator C de coagulação Limulus , produzida por células de inseto geneticamente modificadas. (A sequência específica do fator C usada não vem necessariamente do caranguejo-ferradura do Atlântico.)
Em vez de emular toda a via de coagulação, os testes de rFC permitem que o fator C clive uma molécula fluorogênica, de modo que a amostra acenda quando a endotoxina ativa o fator. Por não conter fator G, (1,3) -β-D-glucana não causará falsos positivos . Em 2018, as evidências disponíveis mostram que o teste de rFC não é pior do que o teste de LAL.
A adoção do teste de rFC foi lenta, o que começou a mudar em 2012, quando o FDA dos EUA e o Ministério da Saúde europeu o reconheceram como uma alternativa aceita. Sua falta de menção nas farmacopeias permaneceu um problema, pois não havia um bom padrão para a execução do teste em produção. Em 2016, foi adicionado à Farmacopeia Europeia . Uma patente sobre rFC também limitou a adoção até seu vencimento em 2018.
Em 1 de junho de 2020, a Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) decidiu cancelar a proposta de incluir tecnologia recombinante para teste de endotoxinas no capítulo <85> Endotoxinas bacterianas e iniciar o desenvolvimento de um capítulo separado que expande o uso, validação e comparabilidade de testes de endotoxina baseados em reagentes derivados de forma recombinante. Uma orientação separada apenas o capítulo 1085.1 foi proposta pela USP, embora comentários e feedback publicados em 11 de dezembro de 2020 mostrem que as empresas farmacêuticas e o FDA não apóiam este capítulo e solicitam o status de compêndio.
Teste de ativação de monócitos
O teste de ativação de monócitos (MAT) é outro método proposto para testar endotoxinas baseadas em monócitos no sangue humano . Mede a liberação de citocinas destes devido à presença de pirogênios , basicamente espelhando o processo pelo qual essas toxinas causam febre em humanos (e coelhos, como no teste de pirogênio original). Um protocolo para o teste MAT, usando células em cultura, é descrito na Farmacopeia Europeia.