Biblioteca (biologia) - Library (biology)

A mutagênese de saturação do local é um tipo de mutagênese direcionada ao local . Esta imagem mostra a mutagênese de saturação de uma única posição em uma proteína teórica de 10 resíduos. A versão de tipo selvagem da proteína é mostrada no topo, com M representando o primeiro aminoácido metionina e * representando o término da tradução. Todos os 19 mutantes da isoleucina na posição 5 são mostrados abaixo.

Como as bibliotecas de DNA são geradas por mutagênese aleatória no espaço de sequência de amostra. O aminoácido substituído em uma determinada posição é mostrado. Cada ponto ou conjunto de pontos conectados é um membro da biblioteca. A PCR propensa a erros altera aleatoriamente alguns resíduos para outros aminoácidos. A varredura de alanina substitui cada resíduo da proteína por alanina, um por um. A saturação do local substitui cada um dos 20 aminoácidos possíveis (ou algum subconjunto deles) em uma única posição, um por um.

Em biologia molecular , uma biblioteca é uma coleção de fragmentos de DNA que são armazenados e propagados em uma população de microrganismos por meio do processo de clonagem molecular . Existem diferentes tipos de bibliotecas de DNA, incluindo bibliotecas de cDNA (formadas a partir de RNA transcrito reversamente ), bibliotecas genômicas (formadas a partir de DNA genômico) e bibliotecas mutantes aleatórias (formadas por síntese de genes de novo onde nucleotídeos alternativos ou códons são incorporados). A tecnologia de biblioteca de DNA é um pilar da biologia molecular , engenharia genética e engenharia de proteínas atuais , e as aplicações dessas bibliotecas dependem da fonte dos fragmentos de DNA originais. Existem diferenças nos vetores de clonagem e técnicas usadas na preparação da biblioteca, mas em geral cada fragmento de DNA é inserido exclusivamente em um vetor de clonagem e o pool de moléculas de DNA recombinante é então transferido para uma população de bactérias (um cromossomo artificial bacteriano ou biblioteca BAC ) ou levedura de modo que cada organismo contenha em média uma construção (vetor + inserção). À medida que a população de organismos cresce em cultura, as moléculas de DNA contidas neles são copiadas e propagadas (portanto, "clonadas").

Terminologia

O termo "biblioteca" pode referir-se a uma população de organismos, cada um dos quais carrega uma molécula de DNA inserida em um vetor de clonagem ou, alternativamente, à coleção de todas as moléculas de vetor clonadas.

Bibliotecas de cDNA

Uma biblioteca de cDNA representa uma amostra do mRNA purificado de uma fonte particular (uma coleção de células, um tecido particular ou um organismo inteiro), que foi convertido de volta em um molde de DNA pelo uso da enzima transcriptase reversa . Portanto, representa os genes que estavam sendo ativamente transcritos naquela fonte particular sob as condições fisiológicas, de desenvolvimento ou ambientais que existiam quando o mRNA foi purificado. As bibliotecas de cDNA podem ser geradas usando técnicas que promovem clones de "comprimento total" ou sob condições que geram fragmentos mais curtos usados ​​para a identificação de " marcadores de sequência expressa ".

As bibliotecas de cDNA são úteis na genética reversa, mas representam apenas uma porção muito pequena (menos de 1%) do genoma geral de um determinado organismo.

As aplicações de bibliotecas de cDNA incluem:

• Descoberta de novos genes
• Clonagem de moléculas de cDNA de comprimento total para estudo in vitro da função do gene
• Estudo do repertório de mRNAs expressos em diferentes células ou tecidos
• Estudo de splicing alternativo em diferentes células ou tecidos

Bibliotecas genômicas

Uma biblioteca genômica é um conjunto de clones que juntos representam todo o genoma de um determinado organismo. O número de clones que constituem uma biblioteca genômica depende (1) do tamanho do genoma em questão e (2) do tamanho do inserto tolerado pelo sistema de vetor de clonagem particular . Para a maioria dos propósitos práticos, a fonte de tecido do DNA genômico não é importante porque cada célula do corpo contém DNA virtualmente idêntico (com algumas exceções).

As aplicações de bibliotecas genômicas incluem:

• Determinar a sequência completa do genoma de um determinado organismo (ver projeto genoma )
• Servindo como fonte de sequência genômica para geração de animais transgênicos por meio de engenharia genética
• Estudo da função de sequências regulatórias in vitro
• Estudo de mutações genéticas em tecidos cancerosos

Bibliotecas mutantes sintéticas

Descrição de uma maneira comum de clonar uma biblioteca de mutagênese dirigida ao local (ou seja, usando oligos degenerados). O gene de interesse é PCRed com oligos que contêm uma região que é perfeitamente complementar ao template (azul), e uma que difere do template por um ou mais nucleotídeos (vermelho). Muitos desses primers contendo degenerescência na região não complementar são agrupados na mesma PCR, resultando em muitos produtos de PCR diferentes com mutações diferentes naquela região (mutantes individuais mostrados com cores diferentes abaixo).

Em contraste com os tipos de biblioteca descritos acima, existe uma variedade de métodos artificiais para fazer bibliotecas de genes variantes. A variação ao longo do gene pode ser introduzida aleatoriamente por PCR propenso a erros , DNA shuffling para recombinar partes de genes semelhantes ou métodos baseados em transposon para introduzir indels . Alternativamente, as mutações podem ser direccionadas para codões específicos durante de novo de síntese ou de mutagénese de saturação para a construção de um ou mais mutantes pontuais de um gene de uma forma controlada. Isso resulta em uma mistura de moléculas de DNA de fita dupla que representam variantes do gene original.

As proteínas expressas a partir dessas bibliotecas podem então ser rastreadas para variantes que exibem propriedades favoráveis ​​(por exemplo, estabilidade, afinidade de ligação ou atividade enzimática). Isso pode ser repetido em ciclos de criação de variantes de genes e triagem dos produtos de expressão em um processo de evolução direcionado .

Visão geral das técnicas de preparação de biblioteca de cDNA

Extração de DNA

Se estiver criando uma biblioteca de mRNA (ou seja, com clones de cDNA), existem vários protocolos possíveis para isolar mRNA de comprimento total. Para extrair DNA para bibliotecas de DNA genômico (também conhecido como gDNA), uma mini-preparação de DNA pode ser útil.

Preparar inserções

Bibliotecas de cDNA requerem cuidado para garantir que clones completos de mRNA sejam capturados como cDNA (que mais tarde será inserido em vetores). Vários protocolos foram concebidos para otimizar a síntese da 1ª fita de cDNA e da 2ª fita de cDNA por esse motivo, e também para tornar a clonagem direcional no vetor mais provável.

Os fragmentos de gDNA são gerados a partir do gDNA extraído usando enzimas de restrição de corte frequente não específicas.

Vetores

As sequências de nucleotídeos de interesse são preservadas como inserções em um plasmídeo ou no genoma de um bacteriófago que foi usado para infectar células bacterianas.

Os vetores são propagados mais comumente em células bacterianas, mas se usar um YAC (Cromossomo Artificial de Levedura), então as células de levedura podem ser usadas. Os vetores também podem ser propagados em vírus, mas isso pode ser demorado e tedioso. No entanto, a alta eficiência de transfecção alcançada pelo uso de vírus (geralmente fagos) os torna úteis para empacotar o vetor (com a inserção ligada) e, em seguida, introduzi-los na célula bacteriana (ou de levedura).

Além disso, para bibliotecas de cDNA, foi desenvolvido um sistema usando o fago Lambda Zap II, ExAssist e 2 espécies de E. coli. Um sistema Cre-Lox usando locais loxP e a expressão in vivo da enzima recombinase também pode ser usado em seu lugar. Estes são exemplos de sistemas de excisão in vivo. A excisão in vitro envolve a subclonagem, muitas vezes usando enzimas de restrição tradicionais e estratégias de clonagem. A excisão in vitro pode ser mais demorada e pode exigir um trabalho mais prático do que os sistemas de excisão in vivo. Em ambos os casos, os sistemas permitem o movimento do vetor do fago para uma célula viva, onde o vetor pode se replicar e se propagar até que a biblioteca seja usada.

Usando bibliotecas

Fluxo de trabalho para triagem de uma biblioteca sintética para identificar células que produzem uma substância química de interesse.

Isso envolve a "triagem" das sequências de interesse. Existem vários métodos possíveis para fazer isso.

Referências

links externos