Imunoeletroforese - Immunoelectrophoresis
Imunoeletroforese é um nome geral para uma série de métodos bioquímicos para separação e caracterização de proteínas com base em eletroforese e reação com anticorpos . Todas as variantes da imunoeletroforese requerem imunoglobulinas , também conhecidas como anticorpos , que reagem com as proteínas a serem separadas ou caracterizadas. Os métodos foram desenvolvidos e usados extensivamente durante a segunda metade do século XX. Em ordem cronológica: análise imunoeletroforética (imunoeletroforese unidimensional ad modum Grabar), imunoeletroforese cruzada (imunoeletroforese quantitativa bidimensional ad modum Clarke e Freeman ou ad modum Laurell), imunoeletroforese unidimensional (imunoeletroforese quantitativa unidimensional ad modum Laurell), imunoeletroforese de foguete fundido ad modum Svendsen e Harboe, imunoeletroforese de afinidade ad modum Bøg-Hansen.
Método
A eletroforese analisa a proteína M no soro e na urina. Os dois princípios principais da imunoeletroforese são a eletroforese de zona e a imunodifusão. A agarose como placas de gel a 1% com cerca de 1 mm de espessura tamponada a pH alto (cerca de 8,6) é tradicionalmente preferida para eletroforese e a reação com anticorpos. A agarose foi escolhida como a matriz do gel porque tem poros grandes permitindo a passagem livre e a separação de proteínas, mas fornece uma âncora para os imunoprecipitados de proteínas e anticorpos específicos. O pH alto foi escolhido porque os anticorpos são praticamente imóveis em pH alto. Um equipamento de eletroforese com placa de resfriamento horizontal era normalmente recomendado para a eletroforese.
Os imunoprecipitados podem ser vistos no gel de agarose úmido, mas são corados com manchas de proteína como Coomassie Brilliant Blue no gel seco. Em contraste com a eletroforese em gel de SDS , a eletroforese em agarose permite condições nativas, preservando a estrutura nativa e as atividades das proteínas sob investigação, portanto, a imunoeletroforese permite a caracterização das atividades enzimáticas e da ligação do ligante, etc., além da separação eletroforética.
A análise imunoeletroforética ad modum Grabar é o método clássico de imunoeletroforese. As proteínas são separadas por eletroforese, então os anticorpos são aplicados em uma calha próxima às proteínas separadas e os imunoprecipitados são formados após um período de difusão das proteínas separadas e dos anticorpos uns contra os outros. A introdução da análise imunoeletroforética deu um grande impulso à química de proteínas, alguns dos primeiros resultados foram a resolução de proteínas em fluidos biológicos e extratos biológicos. Entre as observações importantes feitas estavam o grande número de proteínas diferentes no soro, a existência de várias classes de imunoglobulinas e sua heterogeneidade eletroforética.
A imunoeletroforese cruzada também é chamada de imunoeletroforese quantitativa bidimensional ad modum Clarke e Freeman ou ad modum Laurell. Neste método, as proteínas são primeiro separadas durante a eletroforese de primeira dimensão, então, em vez da difusão em direção aos anticorpos, as proteínas são submetidas a eletroforese em um gel contendo anticorpo na segunda dimensão. A imunoprecipitação ocorrerá durante a eletróforo de segunda dimensão e os imunoprecipitados têm uma forma de sino característica, cada precipitado representando um antígeno, sendo a posição do precipitado dependente da quantidade de proteína, bem como da quantidade de anticorpo específico no gel, então quantificação relativa pode ser realizada. A sensibilidade e o poder de resolução da imunoeletroforese cruzada é diferente da análise imunoeletroforética clássica e há múltiplas variações da técnica úteis para vários fins. A imunoeletroforese cruzada tem sido usada para estudos de proteínas em fluidos biológicos, particularmente soro humano e extratos biológicos.
A imunoeletroforese de foguete é uma imunoeletroforese quantitativa unidimensional. O método foi usado para quantificação de proteínas de soro humano antes que métodos automatizados se tornassem disponíveis.
A imunoeletroforese de foguete fundido é uma modificação da imunoeletroforese quantitativa unidimensional usada para medição detalhada de proteínas em frações de experimentos de separação de proteínas.
A imunoeletroforese de afinidade é baseada em mudanças no padrão eletroforético de proteínas por meio de interação específica ou formação de complexos com outras macromoléculas ou ligantes. A imunoeletroforese de afinidade tem sido usada para estimar constantes de ligação , como por exemplo com lectinas ou para caracterização de proteínas com características específicas como conteúdo de glicano ou ligação de ligante. Algumas variantes da imunoeletroforese de afinidade são semelhantes à cromatografia de afinidade pelo uso de ligantes imobilizados .
A estrutura aberta do imunoprecipitado no gel de agarose permitirá a ligação adicional de anticorpos marcados radioativamente para revelar proteínas específicas. Essa variação tem sido utilizada para identificação de alérgenos por meio da reação com imunoglobulina E (IgE).
Dois fatores determinam que os métodos imunoeletroforéticos não são amplamente utilizados. Primeiro, eles exigem muito trabalho e requerem algum conhecimento manual. Em segundo lugar, eles requerem grandes quantidades de anticorpos policlonais. Hoje, a eletroforese em gel seguida por eletroblotting é o método preferido para a caracterização de proteínas devido à sua facilidade de operação, alta sensibilidade e baixa necessidade de anticorpos específicos. Além disso, as proteínas são separadas por eletroforese em gel com base em seu peso molecular aparente, o que não é realizado por imunoeletroforese, mas, no entanto, os métodos imunoeletroforéticos ainda são úteis quando são necessárias condições não redutoras.
Referências
links externos
- Texto completo editado por Niels H. Axelsen no Scandinavian Journal of Immunology, 1975 Volume 4 Suplemento
- Imunoeletroforese na Biblioteca Nacional de Medicina dos Estados Unidos Medical Subject Headings (MeSH)
- https://web.archive.org/web/20070612225626/http://www.lib.mcg.edu/edu/esimmuno/ch4/immelec.htm
- Imunoeletroforese. Imunodifusão