Imunoeletroforese - Immunoelectrophoresis

Imunoeletroforese cruzada de 2 microLitros de soro humano normal. A eletroforese foi realizada em finas camadas de agarose, o gel da foto tem cerca de 7x7 cm. A parte inferior é o gel de primeira dimensão sem anticorpos, onde o soro foi aplicado na fenda na parte inferior esquerda. A parte superior é o gel de segunda dimensão com anticorpos Dako contra proteínas do soro humano. Mais de 50 proteínas séricas principais podem ser nomeadas.
Fundido imunoelectroforese foguete de uma separação cromatográfica de afinidade de proteínas de soro humano em con A . Uma amostra de 15 microlitros de cada fração é aplicada (começando da esquerda) e deixada difundir por cerca de uma hora, em seguida, a eletróforo foi realizada durante a noite. O pico "a" não é retido, o pico "b" é retido e eluído com metil-manose, a seta indica algumas proteínas ligeiramente retidas.

Imunoeletroforese é um nome geral para uma série de métodos bioquímicos para separação e caracterização de proteínas com base em eletroforese e reação com anticorpos . Todas as variantes da imunoeletroforese requerem imunoglobulinas , também conhecidas como anticorpos , que reagem com as proteínas a serem separadas ou caracterizadas. Os métodos foram desenvolvidos e usados ​​extensivamente durante a segunda metade do século XX. Em ordem cronológica: análise imunoeletroforética (imunoeletroforese unidimensional ad modum Grabar), imunoeletroforese cruzada (imunoeletroforese quantitativa bidimensional ad modum Clarke e Freeman ou ad modum Laurell), imunoeletroforese unidimensional (imunoeletroforese quantitativa unidimensional ad modum Laurell), imunoeletroforese de foguete fundido ad modum Svendsen e Harboe, imunoeletroforese de afinidade ad modum Bøg-Hansen.

Método

A eletroforese analisa a proteína M no soro e na urina. Os dois princípios principais da imunoeletroforese são a eletroforese de zona e a imunodifusão. A agarose como placas de gel a 1% com cerca de 1 mm de espessura tamponada a pH alto (cerca de 8,6) é tradicionalmente preferida para eletroforese e a reação com anticorpos. A agarose foi escolhida como a matriz do gel porque tem poros grandes permitindo a passagem livre e a separação de proteínas, mas fornece uma âncora para os imunoprecipitados de proteínas e anticorpos específicos. O pH alto foi escolhido porque os anticorpos são praticamente imóveis em pH alto. Um equipamento de eletroforese com placa de resfriamento horizontal era normalmente recomendado para a eletroforese.

Os imunoprecipitados podem ser vistos no gel de agarose úmido, mas são corados com manchas de proteína como Coomassie Brilliant Blue no gel seco. Em contraste com a eletroforese em gel de SDS , a eletroforese em agarose permite condições nativas, preservando a estrutura nativa e as atividades das proteínas sob investigação, portanto, a imunoeletroforese permite a caracterização das atividades enzimáticas e da ligação do ligante, etc., além da separação eletroforética.

A análise imunoeletroforética ad modum Grabar é o método clássico de imunoeletroforese. As proteínas são separadas por eletroforese, então os anticorpos são aplicados em uma calha próxima às proteínas separadas e os imunoprecipitados são formados após um período de difusão das proteínas separadas e dos anticorpos uns contra os outros. A introdução da análise imunoeletroforética deu um grande impulso à química de proteínas, alguns dos primeiros resultados foram a resolução de proteínas em fluidos biológicos e extratos biológicos. Entre as observações importantes feitas estavam o grande número de proteínas diferentes no soro, a existência de várias classes de imunoglobulinas e sua heterogeneidade eletroforética.

Plasmodium glutamato desidrogenase (pGluDH) separados por Contraimunoeletroforese

A imunoeletroforese cruzada também é chamada de imunoeletroforese quantitativa bidimensional ad modum Clarke e Freeman ou ad modum Laurell. Neste método, as proteínas são primeiro separadas durante a eletroforese de primeira dimensão, então, em vez da difusão em direção aos anticorpos, as proteínas são submetidas a eletroforese em um gel contendo anticorpo na segunda dimensão. A imunoprecipitação ocorrerá durante a eletróforo de segunda dimensão e os imunoprecipitados têm uma forma de sino característica, cada precipitado representando um antígeno, sendo a posição do precipitado dependente da quantidade de proteína, bem como da quantidade de anticorpo específico no gel, então quantificação relativa pode ser realizada. A sensibilidade e o poder de resolução da imunoeletroforese cruzada é diferente da análise imunoeletroforética clássica e há múltiplas variações da técnica úteis para vários fins. A imunoeletroforese cruzada tem sido usada para estudos de proteínas em fluidos biológicos, particularmente soro humano e extratos biológicos.

A imunoeletroforese de foguete é uma imunoeletroforese quantitativa unidimensional. O método foi usado para quantificação de proteínas de soro humano antes que métodos automatizados se tornassem disponíveis.

A imunoeletroforese de foguete fundido é uma modificação da imunoeletroforese quantitativa unidimensional usada para medição detalhada de proteínas em frações de experimentos de separação de proteínas.

A imunoeletroforese de afinidade é baseada em mudanças no padrão eletroforético de proteínas por meio de interação específica ou formação de complexos com outras macromoléculas ou ligantes. A imunoeletroforese de afinidade tem sido usada para estimar constantes de ligação , como por exemplo com lectinas ou para caracterização de proteínas com características específicas como conteúdo de glicano ou ligação de ligante. Algumas variantes da imunoeletroforese de afinidade são semelhantes à cromatografia de afinidade pelo uso de ligantes imobilizados .

A estrutura aberta do imunoprecipitado no gel de agarose permitirá a ligação adicional de anticorpos marcados radioativamente para revelar proteínas específicas. Essa variação tem sido utilizada para identificação de alérgenos por meio da reação com imunoglobulina E (IgE).

Dois fatores determinam que os métodos imunoeletroforéticos não são amplamente utilizados. Primeiro, eles exigem muito trabalho e requerem algum conhecimento manual. Em segundo lugar, eles requerem grandes quantidades de anticorpos policlonais. Hoje, a eletroforese em gel seguida por eletroblotting é o método preferido para a caracterização de proteínas devido à sua facilidade de operação, alta sensibilidade e baixa necessidade de anticorpos específicos. Além disso, as proteínas são separadas por eletroforese em gel com base em seu peso molecular aparente, o que não é realizado por imunoeletroforese, mas, no entanto, os métodos imunoeletroforéticos ainda são úteis quando são necessárias condições não redutoras.

Referências

links externos