Cromatografia de deslocamento - Displacement chromatography
A cromatografia de deslocamento é uma técnica de cromatografia em que uma amostra é colocada no topo da coluna e, em seguida, é deslocada por um soluto que é mais fortemente absorvido do que os componentes da mistura original. O resultado é que os componentes são resolvidos em zonas "retangulares" consecutivas de substâncias puras altamente concentradas, em vez de "picos" separados por solvente. É principalmente uma técnica preparativa; maior concentração de produto, maior pureza e maior rendimento podem ser obtidos em comparação com outros modos de cromatografia.
Descoberta
O advento da cromatografia de deslocamento pode ser atribuído a Arne Tiselius , que em 1943 classificou os modos de cromatografia como frontal, eluição e deslocamento. A cromatografia de deslocamento encontrou uma variedade de aplicações, incluindo o isolamento de elementos transurânicos e entidades bioquímicas. A técnica foi refeita por Csaba Horváth , que empregou modernos equipamentos e colunas de alta pressão. Desde então, encontrou muitas aplicações, particularmente no domínio da purificação de macromoléculas biológicas.
Princípio
O princípio básico da cromatografia de deslocamento é: há apenas um número finito de sítios de ligação para solutos na matriz (a fase estacionária) e, se um sítio for ocupado por uma molécula, não estará disponível para outras. Como em qualquer cromatografia, o equilíbrio é estabelecido entre as moléculas de um determinado tipo ligadas à matriz e as do mesmo tipo livres em solução. Como o número de locais de ligação é finito, quando a concentração de moléculas livres em solução é grande em relação à constante de dissociação dos locais, esses locais serão principalmente preenchidos. Isso resulta em uma curvatura para baixo no gráfico de soluto ligado vs soluto livre, no caso mais simples fornecendo uma isoterma de Langmuir . Uma molécula com alta afinidade pela matriz (o deslocador) competirá com mais eficácia pelos locais de ligação, deixando a fase móvel enriquecida no soluto de baixa afinidade. O fluxo da fase móvel através da coluna transporta preferencialmente o soluto de baixa afinidade e, portanto, em alta concentração, o soluto de alta afinidade irá eventualmente deslocar todas as moléculas com afinidades menores.
Modo de operação
Carregando
No início da execução, uma mistura de solutos a serem separados é aplicada à coluna, em condições selecionadas para promover alta retenção. Os solutos de afinidade mais alta são preferencialmente retidos perto da cabeça da coluna, com os solutos de afinidade mais baixa movendo-se mais a jusante. O componente de movimento mais rápido começa a formar uma zona pura a jusante. Os outros componentes também começam a formar zonas, mas o fornecimento contínuo da alimentação mista no topo da coluna impede a resolução total.
Deslocamento
Depois que toda a amostra é carregada, a alimentação é trocada para o deslocador, escolhido para ter maior afinidade do que qualquer componente da amostra. O deslocador forma uma zona de arestas vivas na cabeça da coluna, empurrando os outros componentes rio abaixo. Cada componente da amostra agora atua como um deslocador para os solutos de baixa afinidade, e os solutos se classificam em uma série de bandas contíguas (um "trem de deslocamento"), todos se movendo a jusante na taxa definida pelo deslocador. O tamanho e o carregamento da coluna são escolhidos para permitir que esse processo de classificação seja concluído antes que os componentes atinjam a parte inferior da coluna. Os solutos aparecem na parte inferior da coluna como uma série de zonas contíguas, cada uma consistindo em um componente purificado, com a concentração dentro de cada zona individual efetivamente uniforme.
Regeneração
Após a eluição do último soluto, é necessário retirar o deslocador da coluna. Como o deslocador foi escolhido para alta afinidade, isso pode representar um desafio. Em materiais de fase reversa, uma lavagem com uma alta porcentagem de solvente orgânico pode ser suficiente. Grandes mudanças de pH também são freqüentemente empregadas. Uma estratégia eficaz é remover o deslocador por reação química; por exemplo, se íon de hidrogênio foi usado como deslocador, ele pode ser removido por reação com hidróxido, ou um íon de metal polivalente pode ser removido por reação com um agente quelante. Para algumas matrizes, os grupos reativos na fase estacionária podem ser titulados para eliminar temporariamente os locais de ligação, por exemplo, trocadores de íons de ácido fraco ou resinas quelantes podem ser convertidos na forma protonada. Para trocadores de íons do tipo gel, a reversão de seletividade com força iônica muito alta também pode fornecer uma solução. Às vezes, o deslocador é projetado especificamente com um grupo funcional titulável para mudar sua afinidade. Depois que o deslocador é lavado, a coluna é lavada conforme necessário para restaurá-la ao seu estado inicial para a próxima execução.
Comparação com cromatografia de eluição
Fundamentos comuns
Em qualquer forma de cromatografia, a taxa na qual o soluto desce na coluna é um reflexo direto da porcentagem de tempo que o soluto passa na fase móvel. Para conseguir a separação em cromatografia de eluição ou deslocamento, deve haver diferenças apreciáveis na afinidade dos respectivos solutos para a fase estacionária. Ambos os métodos dependem do movimento para baixo na coluna para amplificar o efeito de pequenas diferenças na distribuição entre as duas fases. A distribuição entre as fases móvel e estacionária é descrita pela isoterma de ligação, um gráfico de soluto ligado (ou particionado) na fase estacionária em função da concentração na fase móvel. A isotérmica é frequentemente linear, ou aproximadamente, em baixas concentrações, mas normalmente se curva (côncava para baixo) em concentrações mais altas conforme a fase estacionária se torna saturada.
Características do modo de eluição
No modo de eluição, os solutos são aplicados à coluna como bandas estreitas e, em baixa concentração, movem-se para baixo na coluna como aproximadamente picos gaussianos . Esses picos continuam a se alargar à medida que viajam, em proporção à raiz quadrada da distância percorrida. Para que duas substâncias sejam resolvidas, elas devem migrar para baixo na coluna em taxas suficientemente diferentes para superar os efeitos do espalhamento da faixa. Operar em alta concentração, onde a isoterma é curva, é desvantajoso na cromatografia de eluição porque a taxa de deslocamento depende da concentração, fazendo com que os picos se espalhem e distorçam.
A retenção na cromatografia de eluição é geralmente controlada ajustando a composição da fase móvel (em termos de composição do solvente, pH, força iônica e assim por diante) de acordo com o tipo de fase estacionária empregada e os solutos particulares a serem separados. Os componentes da fase móvel geralmente têm menor afinidade para a fase estacionária do que os solutos sendo separados, mas estão presentes em maior concentração e alcançam seus efeitos devido à ação da massa . A resolução na cromatografia de eluição é geralmente melhor quando os picos são fortemente retidos, mas as condições que dão boa resolução dos picos iniciais levam a longos tempos de execução e alargamento excessivo dos picos posteriores, a menos que eluição de gradiente seja empregada. O equipamento gradiente adiciona complexidade e despesas, especialmente em grande escala.
Vantagens e desvantagens do modo de deslocamento
Em contraste com a cromatografia de eluição, os solutos separados no modo de deslocamento formam zonas de arestas agudas em vez de picos de propagação. Os limites da zona na cromatografia de deslocamento são autoafiados: se uma molécula por algum motivo se adiantar à sua banda, ela entra em uma zona na qual é mais fortemente retida e, então, correrá mais devagar até que sua zona alcance. Além disso, como a cromatografia de deslocamento tira vantagem da não linearidade das isotermas, as cargas são deliberadamente altas; mais material pode ser separado em uma determinada coluna, em um determinado tempo, com os componentes purificados recuperados em concentrações significativamente mais altas. As condições de retenção ainda podem ser ajustadas, mas o deslocador controla a taxa de migração dos solutos. O deslocador é selecionado para ter maior afinidade para a fase estacionária do que qualquer um dos solutos sendo separados, e sua concentração é ajustada para se aproximar da saturação da fase estacionária e dar a taxa de migração desejada da onda de concentração. Condições de alta retenção podem ser empregadas sem operação de gradiente, porque o deslocador garante a remoção de todos os solutos de interesse no tempo de execução projetado.
Por causa do efeito de concentração do carregamento da coluna em condições de alta retenção, a cromatografia de deslocamento é bem adequada para purificar componentes de fluxos de alimentação diluídos. No entanto, também é possível concentrar o material de uma corrente diluída na cabeça de uma coluna cromatográfica e, em seguida, mudar as condições para eluir o material adsorvido nos modos isocrático convencional ou gradiente. Portanto, esta abordagem não é exclusiva para cromatografia de deslocamento, embora a maior capacidade de carga e menos diluição permitam maior concentração no modo de deslocamento.
Uma desvantagem da cromatografia de deslocamento é que as não idealidades sempre dão origem a uma zona de sobreposição entre cada par de componentes; esta zona mista deve ser coletada separadamente para reciclagem ou descarte para preservar a pureza dos materiais separados. A estratégia de adicionar moléculas espaçadoras para formar zonas entre os componentes (às vezes denominada "cromatografia de deslocamento de transportador") foi investigada e pode ser útil quando espaçadores adequados e facilmente removíveis são encontrados. Outra desvantagem é que o cromatograma bruto, por exemplo, um gráfico de absorbância ou índice de refração vs volume de eluição, pode ser difícil de interpretar para zonas contíguas, especialmente se o trem de deslocamento não estiver totalmente desenvolvido. A documentação e a solução de problemas podem exigir análises químicas adicionais para estabelecer a distribuição de um determinado componente. Outra desvantagem é que o tempo necessário para a regeneração limita a taxa de transferência.
De acordo com o artigo de John C. Ford na Encyclopedia of Chromatography , estudos teóricos indicam que, pelo menos para alguns sistemas, a cromatografia de eluição sobrecarregada otimizada oferece maior rendimento do que a cromatografia de deslocamento, embora testes experimentais limitados sugiram que a cromatografia de deslocamento é superior (pelo menos antes da consideração de tempo de regeneração).
Formulários
Historicamente, a cromatografia de deslocamento foi aplicada a separações preparativas de aminoácidos e elementos de terras raras e também foi investigada para a separação de isótopos.
Proteínas
A purificação cromatográfica de proteínas de misturas complexas pode ser bastante desafiadora, particularmente quando as misturas contêm proteínas retidas de forma semelhante ou quando é desejado enriquecer componentes residuais na alimentação. Além disso, o carregamento da coluna é frequentemente limitado quando altas resoluções são necessárias usando modos tradicionais de cromatografia (por exemplo, gradiente linear, cromatografia isocrática ). Nesses casos, a cromatografia de deslocamento é uma técnica eficiente para a purificação de proteínas de misturas complexas em cargas de coluna altas em uma variedade de aplicações.
Um importante avanço no estado da arte da cromatografia de deslocamento foi o desenvolvimento de deslocadores de baixa massa molecular para purificação de proteínas em sistemas de troca iônica. Esta pesquisa foi significativa porque representou um grande afastamento da sabedoria convencional de que grandes polímeros polieletrólitos são necessários para deslocar proteínas em sistemas de troca iônica.
Deslocadores de baixa massa molecular têm vantagens operacionais significativas em comparação com grandes deslocadores de polieletrólito. Por exemplo, se houver qualquer sobreposição entre o deslocador e a proteína de interesse, esses materiais de baixa massa molecular podem ser facilmente separados da proteína purificada durante o processamento pós-deslocamento usando métodos de purificação baseados em tamanho padrão (por exemplo , cromatografia de exclusão de tamanho , ultrafiltração ) . Além disso, o comportamento de adsorção dependente de sal desses deslocadores de baixo MW facilita muito a regeneração da coluna. Esses deslocadores têm sido empregados para uma ampla variedade de separações de alta resolução em sistemas de troca iônica. Além disso, a utilidade da cromatografia de deslocamento para a purificação de fatores de crescimento recombinantes , proteínas de vacina antigênica e oligonucleotídeos antisense também foi demonstrada. Existem vários exemplos em que a cromatografia de deslocamento foi aplicada à purificação de proteínas usando troca iônica , interação hidrofóbica , bem como cromatografia de fase reversa .
A cromatografia de deslocamento é adequada para obter quantidades de mg de proteínas purificadas de misturas complexas usando colunas de cromatografia analítica padrão em escala de bancada. Também é particularmente adequado para enriquecer componentes residuais na ração. A cromatografia de deslocamento pode ser prontamente realizada usando uma variedade de sistemas de resina, incluindo, troca iônica, HIC e RPLC
Cromatografia bidimensional
A cromatografia bidimensional representa a abordagem mais completa e rigorosa para a avaliação do proteoma . Embora as abordagens anteriormente aceitas tenham utilizado abordagens cromatográficas de modo de eluição, como troca catiônica para HPLC de fase reversa , os rendimentos são tipicamente muito baixos, exigindo sensibilidades analíticas na faixa de picomolar a femtomolar. Como a cromatografia de deslocamento oferece a vantagem de concentração de componentes de rastreamento, a cromatografia bidimensional utilizando deslocamento em vez de modo de eluição na etapa de cromatografia a montante representa uma ferramenta potencialmente poderosa para análise de componentes de rastreamento, modificações e identificação de componentes menores expressos do proteoma.