Microcompartimento bacteriano - Bacterial microcompartment
Os microcompartimentos bacterianos ( BMCs ) são estruturas semelhantes a organelas , consistindo em uma camada protéica que envolve enzimas e outras proteínas . Os BMCs têm normalmente cerca de 40–200 nanômetros de diâmetro e são feitos inteiramente de proteínas. A casca funciona como uma membrana, pois é seletivamente permeável. Outros compartimentos baseados em proteínas encontrados em bactérias e arquéias incluem nanocompartimentos de encapsulina e vesículas de gás .
Descoberta
Os primeiros BMCs foram observados na década de 1950 em micrografias eletrônicas de cianobactérias , e mais tarde foram chamados de carboxissomos após seu papel na fixação de carbono ter sido estabelecido. Até a década de 1990, os carboxissomos eram considerados uma raridade confinada a certas bactérias autotróficas . Mas, em seguida, genes que codificam para proteínas homólogas às do escudo carboxissoma foram identificados no PDU (utilização de propanodiol) e eut (utilização de etanolamina) operões . Posteriormente, micrografias eletrônicas de transmissão de células de Salmonella cultivadas em propanodiol ou etanolamina mostraram a presença de corpos poliédricos semelhantes aos carboxissomos. O termo metabolossoma é usado para se referir a tais BMCs catabólicos (em contraste com o carboxissomo autotrófico).
Embora os BMCs carboxysome, propanodiol utilizando (PDU) e etanolamina utilizando (EUT) encapsulem enzimas diferentes e, portanto, tenham funções diferentes, os genes que codificam para as proteínas da casca são muito semelhantes. A maioria dos genes (que codificam as proteínas da casca e as enzimas encapsuladas) de BMCs caracterizados experimentalmente estão localizados próximos uns dos outros em loci ou operons genéticos distintos . Existem atualmente mais de 20.000 genomas bacterianos sequenciados e métodos de bioinformática podem ser usados para encontrar todos os genes shell BMC e ver quais outros genes estão nas proximidades, produzindo uma lista de BMCs potenciais. Em 2014, uma pesquisa abrangente identificou 23 loci diferentes que codificam até 10 BMCs funcionalmente distintos em 23 filos bacterianos . Em 2021, em uma análise de mais de 40.000 sequências de proteínas de shell, foi mostrado que pelo menos 45 filos têm membros que codificam BMCs, e o número de tipos e subtipos funcionais aumentou para 68. O papel dos BMCs no microbioma humano também é tornando-se claro.
Cartuchos
Famílias de proteínas formando a casca
A casca do BMC parece icosaédrica ou quase icosaédrica e é formada por subunidades proteicas (pseudo) hexaméricas e pentaméricas . Estruturas de conchas intactas foram determinadas para três funcionalmente distintas: tipos de BMC, carboxissomos, as organelas GRM2 envolvidas no catabolismo da colina e um metabolossomo de função desconhecida. Coletivamente, essas estruturas mostraram que os princípios básicos da montagem da casca são universalmente conservados em BMCs funcionalmente distintos.
A família de proteínas de shell BMC
Os principais constituintes do invólucro BMC são proteínas contendo domínio (s) Pfam00936. Essas proteínas formam oligômeros que têm formato hexagonal e formam as facetas da casca.
Proteínas de domínio único (BMC-H)
As proteínas BMC-H, que contêm uma única cópia do domínio Pfam00936, são o componente mais abundante das facetas da casca. As estruturas cristalinas de várias dessas proteínas foram determinadas, mostrando que elas se agrupam em hexâmeros cíclicos, normalmente com um pequeno poro no centro. Esta abertura é proposta para estar envolvida no transporte seletivo de pequenos metabólitos através da casca. A maioria dos BMCs contém vários tipos distintos de proteínas BMC-H (parálogos) que se agrupam para formar as facetas , provavelmente refletindo a gama de metabólitos que devem entrar e sair da casca.
Proteínas de domínio tandem (BMC-T)
Um subconjunto de proteínas shell são compostas por cópias em tandem (fundidas) do domínio Pfam00936 (proteínas BMC-T), este evento evolutivo foi recriado em laboratório pela construção de uma proteína BMC-T sintética. As proteínas BMC-T estruturalmente caracterizadas formam trímeros com forma pseudo-hexamérica. Algumas estruturas de cristal BMC-T mostram que os trímeros podem ser empilhados face a face. Em tais estruturas, um poro de um trímero está em uma conformação "aberta", enquanto o outro está fechado - sugerindo que pode haver um mecanismo semelhante a uma eclusa de ar que modula a permeabilidade de algumas conchas BMC. Esta porta parece estar coordenada em toda a superfície da concha. Outro subconjunto de proteínas BMC-T contém um cluster [4Fe-4S] e pode estar envolvido no transporte de elétrons através da camada BMC. Centros de metal também foram projetados em proteínas BMC-T para a condução de elétrons.
A família EutN / CcmL (BMC-P)
Doze unidades pentagonais são necessárias para cobrir os vértices de uma concha icosaédrica. Estruturas cristalinas de proteínas da família EutN / CcmL (Pfam03319) foram resolvidas e normalmente formam pentâmeros (BMC-P). A importância das proteínas BMC-P na formação da casca parece variar entre os diferentes BMCs. Foi demonstrado que eles são necessários para a formação da casca do PDU BMC como mutantes nos quais o gene para a proteína BMC-P foi deletado não podem formar cascas, mas não para o alfa-carboxissomo: sem as proteínas BMC-P, os carboxissomos ainda vai se reunir e muitos são alongados; esses carboxissomos mutantes parecem “vazar”.
Evolução de BMCs e relação com capsídeos virais
Embora o invólucro do BMC seja arquiteturalmente semelhante a muitos capsídeos virais, não foi constatado que as proteínas do invólucro tenham qualquer homologia estrutural ou de sequência com as proteínas do capsídeo. Em vez disso, as comparações estruturais e de sequência sugerem que tanto BMC-H (e BMC-T) e BMC-P, muito provavelmente, evoluíram de proteínas celulares genuínas, a saber, proteína de sinalização PII e proteína contendo domínio de dobra de OB, respectivamente.
Permeabilidade da casca
Está bem estabelecido que as enzimas são empacotadas dentro do invólucro do BMC e que algum grau de sequestro de metabólitos e cofatores deve ocorrer. No entanto, outros metabólitos e cofatores também devem cruzar a casca para que os BMCs funcionem. Por exemplo, em carboxissomos, ribulose-1,5-bisfosfato, bicarbonato e fosfoglicerato devem cruzar a casca, enquanto o dióxido de carbono e a difusão de oxigênio são aparentemente limitados. Da mesma forma, para o PDU BMC, a casca deve ser permeável a propanodiol, propanol, propionil-fosfato e, potencialmente, também vitamina B12, mas é claro que o propionaldeído é de alguma forma sequestrado para evitar danos às células. Há algumas evidências de que o ATP também deve cruzar alguns invólucros BMC.
Foi proposto que os poros centrais formados nas placas hexagonais de proteínas da casca são os condutos através dos quais os metabólitos se difundem para dentro da casca. Por exemplo, os poros no invólucro do carboxissomo têm uma carga global positiva, que foi proposta para atrair substratos carregados negativamente, como o bicarbonato. No microcompartimento PDU, experimentos de mutagênese mostraram que o poro da proteína shell PduA é a rota de entrada do substrato de propanodiol. Para metabólitos maiores, um mecanismo de passagem em algumas proteínas BMC-T é aparente. No microcompartimento EUT, o bloqueio do grande poro na proteína da casca EutL é regulado pela presença do principal substrato metabólico, a etanolamina.
A presença de aglomerados de ferro-enxofre em algumas proteínas da camada, presumivelmente no poro central, levou à sugestão de que eles podem servir como um canal através do qual os elétrons podem ser transportados através da camada.
Tipos
Levantamentos abrangentes de dados de sequência do genoma microbiano indicaram mais de 60 funções metabólicas diferentes encapsuladas por invólucros BMC. A maioria está envolvida na fixação de carbono (carboxissomos) ou na oxidação de aldeído (metabolossomas).
Carboxissomos: fixação de carbono
Os carboxissomos encapsulam a ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase / oxigenase (RuBisCO) e a anidrase carbônica em bactérias fixadoras de CO2 como parte de um mecanismo de concentração de CO2. O bicarbonato é bombeado para o citosol e se difunde no carboxissomo, onde a anidrase carbônica o converte em dióxido de carbono, o substrato do RuBisCO. Acredita-se que a concha do carboxissomo seja apenas moderadamente permeável ao dióxido de carbono, o que resulta em um aumento efetivo na concentração de dióxido de carbono em torno de RuBisCO, aumentando assim a fixação de CO2. Os mutantes que carecem de genes que codificam para a concha do carboxissomo exibem um fenótipo de alta exigência de CO2 devido à perda da concentração de dióxido de carbono, resultando no aumento da fixação de oxigênio por RuBisCO. As conchas também foram propostas para restringir a difusão de oxigênio, evitando assim a reação da oxigenase, reduzindo o desperdício de fotorrespiração.
Metabolossomas: oxidação de aldeído
Além dos carboxissomos anabólicos, foram caracterizados vários BMCs catabólicos que participam do metabolismo heterotrófico via aldeídos de cadeia curta; eles são chamados coletivamente de metabolossomas.
Em 2014, foi proposto que, apesar de sua diversidade funcional, a maioria dos metabolossomas compartilham uma química comum encapsulada impulsionada por três enzimas principais: aldeído desidrogenase, álcool desidrogenase e fosfotransacilase. Como os aldeídos podem ser tóxicos e / ou voláteis para as células, acredita-se que sejam sequestrados dentro do metabolossoma. O aldeído é inicialmente fixado à coenzima A por uma aldeído desidrogenase dependente de NAD +, mas esses dois cofatores devem ser reciclados, pois aparentemente não podem cruzar a casca. Essas reações de reciclagem são catalisadas por uma álcool desidrogenase (NAD +) e uma fosfotransacetilase (coenzima A), resultando em um composto acil fosforilado que pode ser facilmente uma fonte de fosforilação em nível de substrato ou entrar no metabolismo central, dependendo se o organismo está crescendo aerobicamente ou anaerobicamente. Parece que a maioria, senão todos, os metabolossomas utilizam essas enzimas essenciais. Os metabolossomos também encapsulam outra enzima específica do substrato inicial do BMC, que gera o aldeído; esta é a enzima de assinatura definida do BMC.
BMCs PDU
Algumas bactérias podem usar 1,2-propanodiol como fonte de carbono. Eles usam um BMC para encapsular várias enzimas usadas nesta via (Sampson e Bobik, 2008). O PDU BMC é normalmente codificado por um locus de gene 21. Esses genes são suficientes para a montagem do BMC, uma vez que podem ser transplantados de um tipo de bactéria para outro, resultando em um metabolossoma funcional no receptor. Este é um exemplo de bioengenharia que também fornece evidências em apoio à hipótese do operon egoísta. O 1,2-propanodiol é desidratado em propionaldeído pela propanodiol desidratase, que requer vitamina B12 como cofator. O propionaldeído causa mutações no DNA e, como resultado, é tóxico para as células, possivelmente explicando por que esse composto é sequestrado dentro de um BMC. Os produtos finais do PDU BMC são propanol e propionil-fosfato, que é então desfosforilado em propionato, gerando um ATP. Propanol e propionato podem ser usados como substratos para o crescimento.
EUT BMCs
Utilização de etanolamina (EUT) BMCs são codificados em diversos tipos de bactérias. A etanolamina é clivada em amônia e acetaldeído pela ação da etanolamina-amônia liase, que também requer vitamina B12 como cofator. O acetaldeído é bastante volátil e observou-se que mutantes deficientes na casca do BMC apresentam um defeito de crescimento e liberam quantidades excessivas de acetaldeído. Foi proposto que o sequestro de acetaldeído no metabolossoma evita sua perda por volatilidade. Os produtos finais do EUT BMC são etanol e acetil-fosfato. O etanol é provavelmente uma fonte de carbono perdida, mas o acetil-fosfato pode gerar ATP ou ser reciclado em acetil-CoA e entrar no ciclo do TCA ou em várias vias biossintéticas.
BMCs PDU / EUT bifuncionais
Algumas bactérias, especialmente aquelas do gênero Listeria , codificam um único locus no qual os genes para PDU e EUT BMCs estão presentes. Ainda não está claro se este é realmente um BMC quimérico com uma mistura de ambos os conjuntos de proteínas, ou se dois BMCs separados são formados.
BMCs contendo enzima de radical glicil (GRM)
Foram identificados vários loci BMC diferentes que contêm enzimas de radical glicil, que obtêm o radical catalítico da clivagem da s-adenosilcobalamina. Foi demonstrado que um locus GRM em Clostridium phytofermentans está envolvido na fermentação de fucose e ramnose, que são inicialmente degradadas a 1,2-propanodiol sob condições anaeróbias. A enzima do radical glicil é proposta para desidratar o propanodiol em propionaldeído, que é então processado de maneira idêntica à PDU BMC canônica.
Planctomicetos e BMCs Verrucomicrobia (PVM)
Linhagens distintas de Planctomycetes e Verrucomicrobia codificam um locus BMC. O locus em Planctomyces limnophilus demonstrou estar envolvido na degradação aeróbia de fucose e ramnose. Acredita-se que uma aldolase gere lactaldeído, que é então processado por meio do BMC, resultando em 1,2-propanodiol e lactal-fosfato.
Rhodococcus and Mycobacterium BMCs (RMM)
Dois tipos de loci BMC foram observados em membros dos gêneros Rhodococcus e Mycobacterium , embora sua função real não tenha sido estabelecida. No entanto, com base na função caracterizada de um dos genes presentes no locus e nas funções preditas dos outros genes, foi proposto que esses loci poderiam estar envolvidos na degradação do amino-2-propanol. O aldeído gerado nesta via prevista seria o composto extremamente tóxico metilglioxal; seu sequestro dentro do BMC pode proteger a célula.
BMCs de função desconhecida (BUF)
Um tipo de locus BMC não contém RuBisCO ou qualquer uma das enzimas metabolossomas centrais, e foi proposto para facilitar uma terceira categoria de transformações bioquímicas (ou seja, nem fixação de carbono nem oxidação de aldeído). A presença de genes que se prevê codificar para amidohidrolases e desaminases pode indicar que este BMC está envolvido no metabolismo de compostos nitrogenados.
conjunto
Carboxissomos
A via de montagem para beta-carboxissomos foi identificada e começa com a proteína CcmM nucleante RuBisCO. CcmM tem dois domínios: um domínio de anidrase gama-carbônica N-terminal seguido por um domínio que consiste em três a cinco repetições de sequências semelhantes a subunidades pequenas RuBisCO. O domínio C-terminal agrega RuBisCO, provavelmente substituindo as pequenas subunidades RuBisCO reais no holoenzima L8-S8, reticulando efetivamente o RuBisCO na célula em um grande agregado, denominado procarboxissoma. O domínio N-terminal de CcmM interage fisicamente com o domínio N-terminal da proteína CcmN, que, por sua vez, recruta as subunidades da proteína de casca hexagonal por meio de um peptídeo de encapsulação em seu C-terminal. Os carboxissomos são, então, alinhados espacialmente na célula cianobacteriana por meio da interação com o citoesqueleto bacteriano, garantindo sua distribuição igual nas células-filhas.
A montagem alfa-carboxissomo pode ser diferente daquela dos beta-carboxissomos, pois eles não possuem proteínas homólogas a CcmN ou CcmM e não possuem peptídeos de encapsulação. Carboxissomos vazios foram observados em micrografias eletrônicas. Algumas micrografias indicam que sua montagem ocorre como uma coalescência simultânea de enzimas e proteínas de casca, em oposição ao modo aparentemente gradual observado para beta-carboxissomos. Foi demonstrado que a formação de alfa-carboxissomos simples em sistemas heterólogos requer apenas subunidades grandes e pequenas de Rubisco, a proteína de ancoragem interna CsoS2 e a proteína de casca principal CsoS1A.
A análise filogenética das proteínas da casca de ambos os tipos de carboxissomos indica que elas evoluíram independentemente, cada uma a partir de ancestrais metabolossomas.
Metabolossomas
A montagem do metabolossoma é provavelmente semelhante à do beta-carboxissomo, por meio de uma agregação inicial das proteínas a serem encapsuladas. As proteínas centrais de muitos metabolossomas agregam-se quando expressas sozinhas. Além disso, muitas proteínas encapsuladas contêm extensões terminais que são surpreendentemente semelhantes ao peptídeo C-terminal de CcmN que recruta proteínas de casca. Estes peptídeos de encapsulação são curtos (cerca de 18 resíduos) e prevê-se que formem alfa-hélices anfipáticas. Foi demonstrado que algumas dessas hélices medeiam o encapsulamento de enzimas nativas em BMCs, bem como proteínas heterólogas (como GFP).
Regulação (genética)
Com exceção dos carboxissomos cianobacterianos, em todos os casos testados, os BMCs são codificados em operons que são expressos apenas na presença de seu substrato. Os loci genéticos para a maioria dos tipos de BMC funcionalmente distintos codificam proteínas reguladoras que podem fornecer informações sobre a função do BMC.
PDU BMCs em Salmonella enterica são induzidos pela presença de propanodiol ou glicerol em condições anaeróbias, e apenas propanodiol em condições aeróbias. Esta indução é mediada pelas proteínas reguladoras globais Crp e ArcA (detectando AMP cíclico e condições anaeróbicas, respectivamente), e a proteína reguladora PocR, que é o ativador da transcrição para ambos os loci pdu e sabugo (o operon necessário para a síntese de vitamina B12, um cofator necessário para a propanodiol desidratase).
EUT BMCs em Salmonella enterica são induzidos através da proteína reguladora EutR pela presença simultânea de etanolamina e vitamina B12, o que pode acontecer em condições aeróbias ou anaeróbias. Salmonella enterica só pode produzir vitamina B12 endógena em condições anaeróbias, embora possa importar cianobalamina e convertê-la em vitamina B12 em condições aeróbias ou anaeróbias.
BMCs PVM em Planctomyces limnophilus são induzidos pela presença de fucose ou ramnose em condições aeróbias, mas não por glicose. Resultados semelhantes foram obtidos para o BMC GRM de Clostridium phytofermentans , para o qual ambos os açúcares induzem os genes que codificam para o BMC, bem como os que codificam para as enzimas dissimilatórias de fucose e ramnose.
Além dos sistemas regulatórios caracterizados, pesquisas de bioinformática indicaram que existem potencialmente muitos outros mecanismos regulatórios, mesmo dentro de um tipo funcional de BMC (por exemplo, PDU), incluindo sistemas regulatórios de dois componentes.
Relevância para a saúde global e humana
Os carboxissomos estão presentes em todas as cianobactérias e em muitas outras bactérias foto e quimioautotróficas. As cianobactérias são impulsionadores globalmente significativos da fixação de carbono e, uma vez que requerem carboxissomos para fazê-lo nas atuais condições atmosféricas, o carboxissomo é o principal componente da fixação global de dióxido de carbono.
Vários tipos de BMCs têm sido implicados na virulência de patógenos, como Salmonella enterica e Listeria monocytogenes . Os genes BMC tendem a ser regulados positivamente em condições de virulência, e mutá-los leva a um defeito de virulência, conforme julgado por experimentos de competição.
Aplicações biotecnológicas
Vários recursos dos BMCs os tornam atraentes para aplicações biotecnológicas. Como os carboxissomos aumentam a eficiência da fixação de carbono, muitos esforços de pesquisa foram feitos para a introdução de carboxissomos e transportadores de bicarbonato necessários em cloroplastos de plantas para criar um mecanismo de concentração de CO2 cloroplástico com algum sucesso. Os carboxissomos também fornecem um exemplo de como o conhecimento de uma via de montagem de BMC permite a simplificação e a redução do número de produtos genéticos necessários para a construção de organelas. Esta é uma consideração especialmente importante para a introdução da compartimentação em organismos difíceis de projetar, como plantas na biologia sintética de plantas. De modo mais geral, como as proteínas de casca BMC se auto-montam, cascas vazias podem ser formadas, solicitando esforços para projetá-las para conter cargas personalizadas. A descoberta do peptídeo de encapsulamento nas terminações de algumas proteínas associadas ao BMC fornece um meio para começar a projetar BMCs personalizados pela fusão de proteínas estranhas a este peptídeo e co-expressando-o com proteínas de casca. Por exemplo, ao adicionar este peptídeo à piruvato descarboxilase e à álcool desidrogenase, os pesquisadores desenvolveram um biorreator de etanol. Estratégias para encapsular proteínas em invólucros sintéticos usando vários domínios adaptadores e fusões para terminações de proteínas de invólucro também foram bem-sucedidas. Finalmente, os poros presentes nas proteínas do invólucro controlam a permeabilidade do invólucro: podem ser um alvo para a bioengenharia, pois podem ser modificados para permitir o cruzamento de substratos e produtos selecionados. A engenharia da permeabilidade foi estendida além dos metabólitos; os poros da proteína da casca foram modificados para conduzir elétrons.
Além do potencial de compartimentalização do metabolismo em bioengenharia, os BMCs sintéticos têm muitas aplicações potenciais como nanoterapêuticos. Avanços técnicos adicionais, como a capacidade de construir conchas in vitro, estão permitindo rapidamente o desenvolvimento de BMCs em biotecnologia.