Microscopia eletrônica de transmissão - Transmission electron microscopy

Uma imagem TEM de um cluster de poliovírus . O vírus da poliomielite tem 30 nm de diâmetro.
Princípio de operação de um microscópio eletrônico de transmissão

A microscopia eletrônica de transmissão ( TEM ) é uma técnica de microscopia na qual um feixe de elétrons é transmitido através de uma amostra para formar uma imagem. O espécime é geralmente uma seção ultrafina com menos de 100 nm de espessura ou uma suspensão em uma grade. Uma imagem é formada a partir da interação dos elétrons com a amostra à medida que o feixe é transmitido através da amostra. A imagem é então ampliada e focada em um dispositivo de imagem, como uma tela fluorescente , uma camada de filme fotográfico ou um sensor, como um cintilador conectado a um dispositivo de carga acoplada .

Os microscópios eletrônicos de transmissão são capazes de gerar imagens com uma resolução significativamente maior do que os microscópios de luz , devido ao menor comprimento de onda de de Broglie dos elétrons. Isso permite que o instrumento capture pequenos detalhes - mesmo tão pequenos quanto uma única coluna de átomos, que é milhares de vezes menor do que um objeto resolvível visto em um microscópio de luz. A microscopia eletrônica de transmissão é um importante método analítico nas ciências físicas, químicas e biológicas. Os TEMs encontram aplicação na pesquisa do câncer , virologia e ciência dos materiais , bem como na poluição , nanotecnologia e pesquisa de semicondutores , mas também em outros campos, como paleontologia e palinologia .

Os instrumentos TEM têm vários modos de operação, incluindo imagens convencionais, imagens de varredura TEM (STEM), difração, espectroscopia e combinações destes. Mesmo na imagem convencional, existem muitas maneiras fundamentalmente diferentes de produzir contraste, chamadas de "mecanismos de contraste de imagem". O contraste pode surgir de diferenças de posição para posição na espessura ou densidade ("contraste de espessura de massa"), número atômico ("contraste Z", referindo-se à abreviatura comum Z para número atômico), estrutura de cristal ou orientação ("cristalográfico contraste "ou" contraste de difração "), as leves mudanças de fase quântica que os átomos individuais produzem nos elétrons que passam por eles (" contraste de fase "), a energia perdida pelos elétrons ao passar pela amostra (" imagem de espectro ") e mais. Cada mecanismo informa ao usuário um tipo diferente de informação, dependendo não apenas do mecanismo de contraste, mas de como o microscópio é usado - as configurações das lentes, aberturas e detectores. O que isso significa é que um TEM é capaz de retornar uma variedade extraordinária de informações de resolução nanométrica e atômica, em casos ideais, revelando não apenas onde estão todos os átomos, mas que tipos de átomos eles são e como estão ligados uns aos outros. Por esta razão, o TEM é considerado uma ferramenta essencial para a nanociência nos campos biológico e de materiais.

O primeiro TEM foi demonstrado por Max Knoll e Ernst Ruska em 1931, com este grupo desenvolvendo o primeiro TEM com resolução maior que a da luz em 1933 e o primeiro TEM comercial em 1939. Em 1986, Ruska recebeu o Prêmio Nobel de Física por o desenvolvimento da microscopia eletrônica de transmissão.

História

Desenvolvimento inicial

O primeiro TEM prático, originalmente instalado no IG Farben-Werke e agora em exibição no Deutsches Museum em Munique, Alemanha
Um microscópio eletrônico de transmissão (1976).

Em 1873, Ernst Abbe propôs que a capacidade de resolver detalhes em um objeto era limitada aproximadamente pelo comprimento de onda da luz usada em imagens ou algumas centenas de nanômetros para microscópios de luz visível. Desenvolvimentos em microscópios ultravioleta (UV), liderados por Köhler e Rohr , aumentaram o poder de resolução por um fator de dois. No entanto, isso exigia uma óptica de quartzo cara, devido à absorção de UV pelo vidro. Acreditava-se que a obtenção de uma imagem com informações submicrométricas não era possível devido a essa restrição de comprimento de onda.

Em 1858, Plücker observou a deflexão de "raios catódicos" ( elétrons ) por campos magnéticos. Este efeito foi usado por Ferdinand Braun em 1897 para construir dispositivos simples de medição de osciloscópio de raios catódicos (CRO). Em 1891, Riecke percebeu que os raios catódicos podiam ser focalizados por campos magnéticos, permitindo designs simples de lentes eletromagnéticas. Em 1926, Hans Busch publicou um trabalho estendendo essa teoria e mostrou que a equação do fabricante da lente poderia, com suposições apropriadas, ser aplicada aos elétrons.

Em 1928, na Universidade Técnica de Berlim , Adolf Matthias, Professor de Tecnologia de Alta Tensão e Instalações Elétricas, nomeou Max Knoll para liderar uma equipe de pesquisadores para o avanço do projeto CRO. A equipe era formada por vários alunos de doutorado, incluindo Ernst Ruska e Bodo von Borries . A equipe de pesquisa trabalhou no design da lente e no posicionamento da coluna CRO, para otimizar os parâmetros para construir CROs melhores e fazer componentes ópticos eletrônicos para gerar imagens de baixa ampliação (quase 1: 1). Em 1931, o grupo gerou com sucesso imagens ampliadas de grades de malha colocadas sobre a abertura do ânodo. O dispositivo usava duas lentes magnéticas para obter ampliações maiores, possivelmente criando o primeiro microscópio eletrônico . No mesmo ano, Reinhold Rudenberg , diretor científico da empresa Siemens , patenteou um microscópio eletrônico de lente eletrostática .

Melhorando a resolução

Na época, os elétrons eram considerados partículas carregadas de matéria; a natureza ondulatória dos elétrons não foi totalmente percebida até a publicação da hipótese de De Broglie em 1927. O grupo de pesquisa de Knoll desconhecia esta publicação até 1932, quando eles rapidamente perceberam que o comprimento de onda de De Broglie dos elétrons era muitas ordens de magnitude menor do que isso para a luz, teoricamente permitindo a geração de imagens em escalas atômicas. (Mesmo para elétrons com energia cinética de apenas 1 volt, o comprimento de onda já é tão curto quanto 1,23  nm .) Em abril de 1932, Ruska sugeriu a construção de um novo microscópio eletrônico para imagens diretas de espécimes inseridos no microscópio, em vez de malha simples grades ou imagens de aberturas. Com este dispositivo, a difração bem-sucedida e a imagem normal de uma folha de alumínio foram alcançadas. No entanto, a ampliação alcançável foi menor do que com a microscopia de luz. Aumentos maiores do que aqueles disponíveis com um microscópio de luz foram alcançados em setembro de 1933 com imagens de fibras de algodão rapidamente adquiridas antes de serem danificadas pelo feixe de elétrons.

Nesta época, o interesse pelo microscópio eletrônico havia aumentado, com outros grupos, como o de Paul Anderson e Kenneth Fitzsimmons da Washington State University e o de Albert Prebus e James Hillier da University of Toronto , que construíram os primeiros TEMs no Norte América em 1935 e 1938, respectivamente, avançando continuamente no design de TEM.

A pesquisa continuou no microscópio eletrônico na Siemens em 1936, onde o objetivo da pesquisa era o desenvolvimento e a melhoria das propriedades de imagem TEM, particularmente no que diz respeito a espécimes biológicos. Nessa época, microscópios eletrônicos estavam sendo fabricados para grupos específicos, como o dispositivo "EM1" usado no Laboratório Físico Nacional do Reino Unido. Em 1939, o primeiro microscópio eletrônico comercial, retratado, foi instalado no departamento de Física da IG Farben -Werke. O trabalho posterior com o microscópio eletrônico foi prejudicado pela destruição de um novo laboratório construído na Siemens por um ataque aéreo , bem como pela morte de dois dos pesquisadores, Heinz Müller e Friedrick Krause, durante a Segunda Guerra Mundial .

Mais pesquisa

Após a Segunda Guerra Mundial, Ruska retomou o trabalho na Siemens, onde continuou a desenvolver o microscópio eletrônico, produzindo o primeiro microscópio com ampliação de 100k. A estrutura fundamental deste projeto de microscópio, com ótica de preparação de feixe de múltiplos estágios, ainda é usada em microscópios modernos. A comunidade mundial de microscopia eletrônica avançou com microscópios eletrônicos sendo fabricados em Manchester, Reino Unido, EUA (RCA), Alemanha (Siemens) e Japão (JEOL). A primeira conferência internacional em microscopia eletrônica foi em Delft em 1949, com mais de cem participantes. As conferências posteriores incluíram a "Primeira" conferência internacional em Paris em 1950 e depois em Londres em 1954.

Com o desenvolvimento do TEM, a técnica associada de microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) foi investigada novamente e permaneceu subdesenvolvida até a década de 1970, com Albert Crewe da Universidade de Chicago desenvolvendo o canhão de emissão de campo e adicionando uma lente objetiva de alta qualidade para criar o STEM moderno. Usando este projeto, Crewe demonstrou a capacidade de criar imagens de átomos usando imagens de campo escuro anulares . Crewe e colegas de trabalho da Universidade de Chicago desenvolveram a fonte de emissão de elétrons de campo frio e construíram um STEM capaz de visualizar átomos pesados ​​em substratos finos de carbono. Em 2008, Jannick Meyer et al. descreveu a visualização direta de átomos leves, como carbono e até mesmo hidrogênio, usando TEM e um substrato de grafeno de camada única limpo.

Fundo

Elétrons

Teoricamente, a resolução máxima, d , que se pode obter com um microscópio de luz, foi limitada pelo comprimento de onda dos fótons (λ) que estão sendo usados ​​para sondar a amostra e a abertura numérica NA do sistema.

onde n é o índice de refração do meio no qual a lente está trabalhando e α é o meio-ângulo máximo do cone de luz que pode entrar na lente (veja a abertura numérica ). Os cientistas do início do século XX teorizaram maneiras de contornar as limitações do comprimento de onda relativamente grande da luz visível (comprimentos de onda de 400-700 nanômetros ) usando elétrons. Como toda matéria, os elétrons têm propriedades tanto de onda quanto de partícula (como teorizado por Louis-Victor de Broglie ), e suas propriedades ondulatórias significam que um feixe de elétrons pode ser focalizado e difratado da mesma forma que a luz. O comprimento de onda dos elétrons está relacionado à sua energia cinética por meio da equação de de Broglie, que diz que o comprimento de onda é inversamente proporcional ao momento. Levando em consideração os efeitos relativísticos (como em um TEM a velocidade de um elétron é uma fração substancial da velocidade da luz,  c ) o comprimento de onda é

onde, h é a constante de Planck , m 0 é a massa de repouso de um elétron e E é a energia cinética do elétron acelerado. Os elétrons são geralmente gerados em um microscópio eletrônico por um processo conhecido como emissão termiônica de um filamento, geralmente tungstênio, da mesma maneira que uma lâmpada ou, alternativamente, pela emissão de elétrons de campo . Os elétrons são então acelerados por um potencial elétrico (medido em volts ) e focalizados por lentes eletrostáticas e eletromagnéticas na amostra. O feixe transmitido contém informações sobre densidade, fase e periodicidade do elétron ; este feixe é usado para formar uma imagem.

Fonte de elétron

Layout de componentes ópticos em um TEM básico
Filamento de tungstênio tipo grampo de cabelo
Cristal único LaB 6 filamento

De cima para baixo, o TEM consiste em uma fonte de emissão ou cátodo, que pode ser um filamento ou agulha de tungstênio , ou uma fonte de cristal único de hexaboreto de lantânio ( LaB 6 ) . O canhão está conectado a uma fonte de alta tensão (normalmente ~ 100–300 kV) e, dada a corrente suficiente, o canhão começará a emitir elétrons por emissão termiônica ou de elétrons de campo no vácuo. No caso de uma fonte termiônica, a fonte de elétrons é normalmente montada em um cilindro Wehnelt para fornecer o foco preliminar dos elétrons emitidos em um feixe enquanto também estabiliza a corrente usando um circuito de feedback passivo. Uma fonte de emissão de campo usa eletrodos eletrostáticos chamados de extrator, um supressor e uma lente de arma, com diferentes tensões em cada um, para controlar a forma e intensidade do campo elétrico perto da ponta afiada. A combinação do cátodo e desses primeiros elementos de lente eletrostática costuma ser chamada coletivamente de "canhão de elétrons". Depois de sair da arma, o feixe é tipicamente acelerado por uma série de placas eletrostáticas até atingir sua tensão final e entrar na próxima parte do microscópio: O sistema de lentes do condensador. Essas lentes superiores do TEM focam ainda mais o feixe de elétrons no tamanho e localização desejados na amostra.

A manipulação do feixe de elétrons é realizada por meio de dois efeitos físicos. A interação dos elétrons com um campo magnético fará com que os elétrons se movam de acordo com a regra da mão esquerda , permitindo assim que os eletroímãs manipulem o feixe de elétrons. O uso de campos magnéticos permite a formação de uma lente magnética de poder de focagem variável, originando-se o formato da lente devido à distribuição do fluxo magnético. Além disso, os campos eletrostáticos podem fazer com que os elétrons sejam desviados em um ângulo constante. O acoplamento de duas deflexões em direções opostas com uma pequena folga intermediária permite a formação de um deslocamento no caminho do feixe, permitindo o deslocamento do feixe em TEM, o que é importante para o STEM . A partir desses dois efeitos, bem como do uso de um sistema de geração de imagens de elétrons, o controle suficiente sobre o caminho do feixe é possível para a operação TEM. A configuração óptica de um TEM pode ser alterada rapidamente, ao contrário de um microscópio óptico, pois as lentes no caminho do feixe podem ser ativadas, ter sua força alterada ou ser desativadas inteiramente simplesmente por meio de comutação elétrica rápida, cuja velocidade é limitada por efeitos como a histerese magnética das lentes.

Óptica

As lentes de um TEM são o que lhe dá sua flexibilidade de modos de operação e capacidade de focalizar feixes até a escala atômica e aumentá-los de volta para obter uma imagem em uma câmera. Uma lente é geralmente feita de uma bobina solenóide quase envolvida por materiais ferromagnéticos projetados para concentrar o campo magnético da bobina em uma forma confinada e precisa. Quando um elétron entra e sai desse campo magnético, ele forma uma espiral em torno das linhas curvas do campo magnético de uma forma que age da mesma forma que uma lente de vidro comum faz com a luz - é uma lente convergente. Mas, ao contrário de uma lente de vidro, uma lente magnética pode facilmente alterar seu poder de foco simplesmente ajustando a corrente que passa pelas bobinas. Isso fornece uma flexibilidade de operação que é ainda mais multiplicada quando as lentes são montadas em pilhas de lentes independentes, cada uma das quais pode focar, desfocar, ampliar e / ou colimar o feixe proveniente da lente anterior. Isso permite que um único sistema de lentes, entre a fonte e a amostra (o sistema de "lentes condensadoras"), produza um feixe paralelo com mais de 1 milímetro de diâmetro, um feixe fortemente focado menor que um átomo, ou qualquer coisa intermediária. Uma pilha de lentes adicional, o sistema de lentes "intermediário / projetor", está após a amostra. Ele pode ser ajustado para produzir um padrão de difração focalizado ou imagem da amostra com uma ampliação variando em uma ampla faixa. Muitos microscópios únicos podem cobrir a faixa de ampliação de aproximadamente 100X a mais de 1.000.000X.

Igualmente importante para as lentes são as aberturas. São orifícios circulares em tiras finas de metal pesado, colocados em pontos bem escolhidos da coluna de lentes. Alguns são fixos em tamanho e posição e desempenham papéis importantes na limitação da geração de raios-X e na melhoria do desempenho do vácuo. Eles também evitam que os elétrons passem pelas partes mais externas das lentes magnéticas que, devido às grandes aberrações das lentes, focam os feixes de elétrons de maneira extremamente deficiente. Outros podem ser alternados livremente entre vários tamanhos diferentes e ter suas posições ajustadas. Essas "aberturas variáveis" são usadas para determinar a corrente do feixe que atinge a amostra e também para melhorar a capacidade de focalizar o feixe. As aberturas variáveis ​​após a posição da amostra permitem ainda ao usuário selecionar a faixa de posições espaciais ou ângulos de espalhamento de elétrons a serem usados ​​na formação de uma imagem ou um padrão de difração. Usadas com habilidade, essas aberturas permitem um estudo extremamente preciso e detalhado dos defeitos dos cristais.

O sistema ótico-eletrônico também inclui defletores e estigmatores, geralmente feitos de pequenos eletroímãs. Ao contrário das lentes, os campos magnéticos produzidos pelos defletores são orientados principalmente para desviar o feixe e não para focalizá-lo. Os defletores permitem que a posição e o ângulo do feixe na posição da amostra sejam controlados de forma independente (como é essencial para o STEM) e também garantem que os feixes permaneçam próximos aos centros de baixa aberração de todas as lentes nas pilhas de lentes. Os estigmatores fornecem uma focagem fina auxiliar, compensando pequenas imperfeições e aberrações que causam astigmatismo - uma lente com uma força focal diferente em diferentes direções.

Normalmente, um TEM consiste em três estágios de lente. Os estágios são as lentes condensadoras, as lentes objetivas e as lentes do projetor. As lentes condensadoras são responsáveis ​​pela formação do feixe primário, enquanto as lentes objetivas focam o feixe que vem através da própria amostra (no modo de varredura STEM, também existem lentes objetivas acima da amostra para tornar o feixe de elétrons incidente convergente). As lentes do projetor são usadas para expandir o feixe na tela de fósforo ou outro dispositivo de imagem, como filme. A ampliação do TEM é devido à razão das distâncias entre a amostra e o plano de imagem da lente objetiva. Estigmatores adicionais permitem a correção de distorções assimétricas do feixe, conhecidas como astigmatismo . É notado que as configurações ópticas do TEM diferem significativamente com a implementação, com os fabricantes usando configurações de lentes personalizadas, como em instrumentos corrigidos de aberração esférica , ou TEMs usando filtragem de energia para corrigir a aberração cromática de elétrons .

Reciprocidade

O teorema da reciprocidade óptica, ou princípio da reciprocidade de Helmholtz , geralmente é verdadeiro para elétrons dispersos elasticamente em um meio absorvente, como costuma ser o caso em condições operacionais TEM padrão. O teorema afirma que a amplitude da onda em algum ponto B como resultado da fonte pontual de elétrons A seria a mesma que a amplitude em A devido a uma fonte pontual equivalente colocada em B. Simplesmente declarada, a função de onda para elétrons focados em qualquer série de componentes ópticos que incluem apenas campos escalares (ou seja, não magnéticos) serão exatamente equivalentes se a fonte de elétrons e o ponto de observação forem invertidos.

Em um TEM, as lentes eletromagnéticas mostraram não interferir visivelmente com as observações de reciprocidade, desde que os processos de espalhamento elástico dominem na amostra e a amostra não seja fortemente magnética. A aplicação cuidadosa do teorema da reciprocidade nos casos em que é válido dá a um usuário de TEM flexibilidade considerável na obtenção e interpretação de imagens e padrões de difração de elétrons. A reciprocidade também pode ser usada para entender a microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) no contexto familiar de TEM e para obter e interpretar imagens usando STEM.

Visor e detectores

Os principais fatores ao considerar a detecção de elétrons incluem eficiência quântica de detecção (DQE) , função de difusão de ponto (PSF) , função de transferência de modulação (MTF) , tamanho de pixel e tamanho de array, ruído, velocidade de leitura de dados e dureza de radiação.

Os sistemas de imagem em um TEM consistem em uma tela de fósforo , que pode ser feita de sulfeto de zinco em partículas finas (10-100 μm) , para observação direta pelo operador e, opcionalmente, um sistema de gravação de imagem, como filme fotográfico , tela YAG dopada CCDs acoplados ou outro detector digital. Normalmente, esses dispositivos podem ser removidos ou inseridos no caminho do feixe pelo operador, conforme necessário. Embora o filme fotográfico possa registrar informações de alta resolução, não é simples de automatizar e os resultados não podem ser visualizados em tempo real. O primeiro relatório do uso de um detector de dispositivo acoplado de carga (CCD) para TEM foi em 1982, mas a tecnologia não encontrou uso generalizado até o final dos anos 1990 / início dos anos 2000. Sensores de pixel ativo monolítico (MAPSs) também foram usados ​​em TEM. Os detectores CMOS , que são mais rápidos e resistentes a danos por radiação do que os CCDs, têm sido usados ​​para TEM desde 2005. No início de 2010, o desenvolvimento da tecnologia CMOS permitiu a detecção de contagens de elétrons únicos ("modo de contagem"). Esses detectores de elétrons diretos estão disponíveis na Gatan , FEI , Detectores Quantum e Direct Electron .

Componentes

A fonte de elétrons do TEM está no topo, onde o sistema de lentes (4,7 e 8) focaliza o feixe no espécime e então o projeta na tela de visualização (10). O controle do feixe está à direita (13 e 14)

Um TEM é composto por vários componentes, que incluem um sistema de vácuo no qual os elétrons viajam, uma fonte de emissão de elétrons para geração do fluxo de elétrons, uma série de lentes eletromagnéticas, bem como placas eletrostáticas. Os dois últimos permitem que o operador guie e manipule a viga conforme necessário. Também é necessário um dispositivo que permita a inserção, movimentação e remoção de amostras do caminho do feixe. Dispositivos de imagem são subsequentemente usados ​​para criar uma imagem dos elétrons que saem do sistema.

Sistema de vácuo

Para aumentar o caminho livre médio da interação do gás de elétron, um TEM padrão é evacuado para baixas pressões, normalmente da ordem de 10-4 Pa . A necessidade disso é dupla: primeiro, a tolerância para a diferença de tensão entre o cátodo e o solo sem gerar um arco e, em segundo lugar, para reduzir a frequência de colisão de elétrons com átomos de gás a níveis desprezíveis - este efeito é caracterizado pelo caminho livre médio . Os componentes TEM, como suportes de amostra e cartuchos de filme, devem ser inseridos ou substituídos rotineiramente, exigindo um sistema com a capacidade de re-evacuar regularmente. Como tal, TEMs são equipados com vários sistemas de bombeamento e eclusas de ar e não são permanentemente selados a vácuo.

O sistema de vácuo para evacuar um TEM para um nível de pressão operacional consiste em vários estágios. Inicialmente, um vácuo baixo ou bruto é alcançado com uma bomba de palheta rotativa ou bombas de diafragma ajustando uma pressão suficientemente baixa para permitir a operação de uma bomba turbo-molecular ou de difusão estabelecendo alto nível de vácuo necessário para as operações. Para permitir que a bomba de baixo vácuo não exija operação contínua, enquanto opera continuamente as bombas turbo-moleculares, o lado do vácuo de uma bomba de baixa pressão pode ser conectado a câmaras que acomodam os gases de exaustão da bomba turbo-molecular. As seções do TEM podem ser isoladas pelo uso de aberturas limitadoras de pressão para permitir diferentes níveis de vácuo em áreas específicas, como um vácuo superior de 10 −4 a 10 −7 Pa ou superior no canhão de elétrons em alta resolução ou campo -emissão TEMs.

TEMs de alta tensão requerem vácuo ultra-alto na faixa de 10-7 a 10-9 Pa para evitar a geração de um arco elétrico, particularmente no cátodo TEM. Como tal, para TEMs de alta tensão, um terceiro sistema de vácuo pode operar, com a pistola isolada da câmara principal por válvulas de gaveta ou uma abertura de bombeamento diferencial - um pequeno orifício que impede a difusão de moléculas de gás para a área da pistola de vácuo superior mais rápido do que eles pode ser bombeado para fora. Para essas pressões muito baixas, é usada uma bomba de íons ou um material absorvedor .

O vácuo insuficiente em um TEM pode causar vários problemas, desde a deposição de gás dentro do TEM sobre a amostra, enquanto vista em um processo conhecido como deposição induzida por feixe de elétrons, até danos catódicos mais graves causados ​​por descarga elétrica. O uso de uma armadilha fria para adsorver gases sublimados na vizinhança da amostra elimina amplamente os problemas de vácuo que são causados ​​pela sublimação da amostra .

Estágio de amostra

Tela de suporte de amostra TEM "grade", com seções de ultramicrotomia

Projetos de estágio de espécime TEM incluem airlocks para permitir a inserção do suporte de espécime no vácuo com perda mínima de vácuo em outras áreas do microscópio. Os suportes de amostra mantêm um tamanho padrão de grade de amostra ou amostra autossustentável. Os tamanhos de grade padrão do TEM são de 3,05 mm de diâmetro, com espessura e tamanho de malha variando de alguns a 100 μm. A amostra é colocada na área de malha com um diâmetro de aproximadamente 2,5 mm. Os materiais usuais da grade são cobre, molibdênio, ouro ou platina. Esta grade é colocada no suporte de amostra, que é emparelhado com o estágio de amostra. Existe uma grande variedade de designs de estágios e suportes, dependendo do tipo de experimento que está sendo executado. Além de grades de 3,05 mm, grades de 2,3 mm são às vezes, se raramente, usadas. Essas grades foram particularmente usadas nas ciências minerais, onde um grande grau de inclinação pode ser necessário e onde o material da amostra pode ser extremamente raro. Espécimes transparentes de elétrons têm uma espessura geralmente menor que 100 nm, mas esse valor depende da tensão de aceleração.

Uma vez inserida em um TEM, a amostra deve ser manipulada para localizar a região de interesse para o feixe, como na difração de grão único , em uma orientação específica. Para acomodar isso, o estágio TEM permite o movimento da amostra no plano XY, ajuste de altura Z e, comumente, uma única direção de inclinação paralela ao eixo dos suportes de entrada lateral. A rotação da amostra pode estar disponível em suportes e estágios de difração especializados. Alguns TEMs modernos fornecem a capacidade de dois ângulos de inclinação ortogonal de movimento com designs de suporte especializados chamados suportes de amostra de dupla inclinação. Alguns designs de estágio, como estágios de entrada superior ou de inserção vertical, uma vez comuns para estudos TEM de alta resolução, podem simplesmente ter apenas a tradução XY disponível. Os critérios de projeto dos estágios TEM são complexos, devido aos requisitos simultâneos de restrições mecânicas e elétron-ópticas, e modelos especializados estão disponíveis para diferentes métodos.

Um estágio TEM é necessário para ter a capacidade de segurar uma amostra e ser manipulado para trazer a região de interesse para o caminho do feixe de elétrons. Como o TEM pode operar em uma ampla gama de ampliações, o estágio deve ser simultaneamente altamente resistente à deriva mecânica, com requisitos de deriva tão baixos quanto alguns nm / minuto enquanto é capaz de se mover vários μm / minuto, com precisão de reposicionamento na ordem de nanômetros. Projetos anteriores de TEM conseguiam isso com um conjunto complexo de dispositivos mecânicos de redução, permitindo ao operador controlar com precisão o movimento do palco por meio de várias hastes rotativas. Dispositivos modernos podem usar projetos de estágio elétrico, usando engrenagens de parafuso em conjunto com motores de passo , fornecendo ao operador uma entrada de estágio baseada em computador, como um joystick ou trackball .

Existem dois designs principais para estágios em um TEM, a versão de entrada lateral e a versão de entrada superior. Cada projeto deve acomodar o suporte correspondente para permitir a inserção do espécime sem danificar a delicada óptica TEM ou permitir que o gás entre nos sistemas TEM sob vácuo.

Um diagrama de um suporte de amostra de inclinação de eixo único para inserção em um goniômetro TEM. A inclinação do suporte é obtida pela rotação de todo o goniômetro

O mais comum é o suporte de entrada lateral, onde a amostra é colocada perto da ponta de uma haste longa de metal (latão ou aço inoxidável), com a amostra colocada plana em um pequeno orifício. Ao longo da haste estão vários anéis de vácuo de polímero para permitir a formação de uma vedação de vácuo de qualidade suficiente, quando inseridos no estágio. O estágio é, portanto, projetado para acomodar a haste, colocando a amostra entre ou perto da lente objetiva, dependendo do projeto da objetiva. Quando inserido no palco, o suporte de entrada lateral tem sua ponta contida no vácuo do TEM, e a base é apresentada à atmosfera, a câmara de descompressão formada pelos anéis de vácuo.

Os procedimentos de inserção para suportes de TEM de entrada lateral normalmente envolvem a rotação da amostra para acionar micro interruptores que iniciam a evacuação da câmara de descompressão antes que a amostra seja inserida na coluna de TEM.

O segundo design é o suporte de entrada superior que consiste em um cartucho de vários cm de comprimento com um orifício perfurado no eixo do cartucho. A amostra é carregada no orifício, possivelmente usando um pequeno anel de parafuso para segurar a amostra no lugar. Este cartucho é inserido em uma eclusa de ar com o orifício perpendicular ao eixo óptico TEM. Quando selada, a eclusa de ar é manipulada para empurrar o cartucho de modo que o cartucho caia no lugar, onde o orifício do orifício fica alinhado com o eixo do feixe, de modo que o feixe desce pelo orifício do cartucho e para dentro da amostra. Esses projetos normalmente não podem ser inclinados sem bloquear o caminho do feixe ou interferir na lente objetiva.

Canhão de elétrons

Diagrama transversal de um conjunto de canhão de elétrons, ilustrando a extração de elétrons

O canhão de elétrons é formado por vários componentes: o filamento, um circuito de polarização, uma capa de Wehnelt e um ânodo de extração. Ao conectar o filamento à fonte de alimentação do componente negativo, os elétrons podem ser "bombeados" do canhão de elétrons para a placa do ânodo e a coluna TEM, completando assim o circuito. O canhão é projetado para criar um feixe de elétrons saindo da montagem em um determinado ângulo, conhecido como semi-ângulo de divergência do canhão, α. Ao construir o cilindro Wehnelt de modo que ele tenha uma carga negativa mais alta do que o próprio filamento, os elétrons que saem do filamento de maneira divergente são, sob operação adequada, forçados a um padrão convergente cujo tamanho mínimo é o diâmetro de cruzamento do canhão.

A densidade de corrente de emissão termiônica, J , pode ser relacionada à função de trabalho do material emissor via lei de Richardson

onde A é a constante de Richardson , Φ é a função trabalho e T é a temperatura do material.

Esta equação mostra que para atingir densidade de corrente suficiente é necessário aquecer o emissor, tomando cuidado para não causar danos pela aplicação de calor excessivo. Por esse motivo, materiais com alto ponto de fusão, como tungstênio, ou com baixa função de trabalho (LaB 6 ), são necessários para o filamento da pistola. Além disso, tanto as fontes termiônicas de hexaboreto de lantânio quanto as de tungstênio devem ser aquecidas para se obter a emissão termiônica, o que pode ser obtido pelo uso de uma pequena tira resistiva. Para evitar choque térmico, muitas vezes há um atraso forçado na aplicação de corrente à ponta, para evitar que gradientes térmicos danifiquem o filamento, o atraso é geralmente de alguns segundos para LaB 6 e significativamente menor para tungstênio.

Lente de elétron

Diagrama de uma lente de design de peça polar dividida TEM

As lentes de elétrons são projetadas para atuar de maneira semelhante à de uma lente óptica, focalizando elétrons paralelos em alguma distância focal constante. As lentes eletrônicas podem operar eletrostaticamente ou magneticamente. A maioria das lentes de elétrons para TEM usa bobinas eletromagnéticas para gerar lentes convexas . O campo produzido para a lente deve ser radialmente simétrico, pois o desvio da simetria radial da lente magnética causa aberrações como astigmatismo e piora a aberração esférica e cromática . As lentes de elétrons são fabricadas a partir de ligas de ferro, ferro-cobalto ou níquel-cobalto, como permalloy . Estes são selecionados por suas propriedades magnéticas, como saturação magnética , histerese e permeabilidade .

Os componentes incluem a culatra, a bobina magnética, os pólos, o pólo e o circuito de controle externo. A peça polar deve ser fabricada de maneira muito simétrica, pois isso fornece as condições de contorno para o campo magnético que forma a lente. Imperfeições na fabricação da peça polar podem induzir distorções severas na simetria do campo magnético, o que induz distorções que acabarão por limitar a capacidade das lentes de reproduzir o plano do objeto. As dimensões exatas da lacuna, o diâmetro interno da peça polar e o cone, bem como o design geral da lente, são frequentemente realizados por análise de elemento finito do campo magnético, considerando as restrições térmicas e elétricas do design.

As bobinas que produzem o campo magnético estão localizadas dentro da culatra da lente. As bobinas podem conter uma corrente variável, mas normalmente usam altas tensões e, portanto, exigem isolamento significativo para evitar curto-circuito nos componentes da lente. Distribuidores térmicos são colocados para garantir a extração do calor gerado pela energia perdida para a resistência dos enrolamentos da bobina. Os enrolamentos podem ser resfriados a água, utilizando uma fonte de água resfriada para facilitar a remoção da alta carga térmica.

Aberturas

As aberturas são placas metálicas anulares, através das quais os elétrons que estão além de uma distância fixa do eixo óptico podem ser excluídos. Eles consistem em um pequeno disco metálico que é suficientemente espesso para evitar que os elétrons passem através do disco, embora permitindo os elétrons axiais. Essa permissão de elétrons centrais em um TEM causa dois efeitos simultaneamente: primeiro, as aberturas diminuem a intensidade do feixe à medida que os elétrons são filtrados do feixe, o que pode ser desejado no caso de amostras sensíveis ao feixe. Em segundo lugar, essa filtragem remove elétrons que estão espalhados em ângulos altos, o que pode ser devido a processos indesejados, como aberração esférica ou cromática, ou devido à difração de interação dentro da amostra.

As aberturas são uma abertura fixa dentro da coluna, como na lente do condensador, ou são uma abertura móvel, que pode ser inserida ou retirada do caminho do feixe, ou movida no plano perpendicular ao caminho do feixe. Conjuntos de abertura são dispositivos mecânicos que permitem a seleção de diferentes tamanhos de abertura, que podem ser usados ​​pelo operador para compensar a intensidade e o efeito de filtragem da abertura. Os conjuntos de abertura geralmente são equipados com micrômetros para mover a abertura, necessária durante a calibração óptica.

Métodos de imagem

Os métodos de imagem em TEM usam as informações contidas nas ondas de elétrons que saem da amostra para formar uma imagem. As lentes do projetor permitem o posicionamento correto dessa distribuição de onda de elétrons no sistema de visualização. A intensidade observada, I , da imagem, assumindo uma qualidade suficientemente alta do dispositivo de imagem, pode ser aproximada como proporcional ao valor absoluto ao quadrado da média do tempo da amplitude das funções de onda de elétrons, onde a onda que forma o feixe de saída é denotada por Ψ.

Diferentes métodos de imagem, portanto, tentam modificar as ondas de elétrons que saem da amostra de uma forma que forneça informações sobre a amostra ou o próprio feixe. Da equação anterior, pode-se deduzir que a imagem observada depende não apenas da amplitude do feixe, mas também da fase dos elétrons, embora os efeitos de fase possam frequentemente ser ignorados em ampliações menores. Imagens de resolução mais alta requerem amostras mais finas e energias mais altas de elétrons incidentes, o que significa que a amostra não pode mais ser considerada como absorvendo elétrons (ou seja, por meio de um efeito da lei de Beer). Em vez disso, a amostra pode ser modelada como um objeto que não altera a amplitude da função de onda do elétron de entrada, mas, em vez disso, modifica a fase da onda de entrada; neste modelo, a amostra é conhecida como um objeto de fase pura. Para amostras suficientemente finas, os efeitos de fase dominam a imagem, complicando a análise das intensidades observadas. Para melhorar o contraste na imagem, o TEM pode ser operado com uma leve desfocagem para aumentar o contraste, devido à convolução pela função de transferência de contraste do TEM, que normalmente diminuiria o contraste se a amostra não fosse um objeto de fase fraca.

Visão esquemática dos modos de imagem e difração em TEM.

A figura à direita mostra os dois modos básicos de operação do TEM - modos de imagem e difração. Em ambos os casos o corpo de prova é iluminado com o feixe paralelo, formado pela conformação do feixe de elétrons com o sistema de lentes do condensador e abertura do condensador. Após a interação com a amostra, na superfície de saída da amostra existem dois tipos de elétrons - não espalhados (que corresponderá ao feixe central brilhante no padrão de difração) e elétrons espalhados (que mudam suas trajetórias devido à interação com o material).

No modo de imagem, a abertura da objetiva é inserida em um plano focal posterior (BFP) da lente objetiva (onde os pontos de difração são formados). Se usar a abertura da objetiva para selecionar apenas o feixe central, os elétrons transmitidos são passados ​​pela abertura enquanto todos os outros são bloqueados e uma imagem de campo claro (imagem BF) é obtida. Se permitirmos o sinal de um feixe difratado, uma imagem de campo escuro (imagem DF) é recebida. O sinal selecionado é ampliado e projetado em uma tela (ou em uma câmera) com a ajuda de lentes intermediárias e de projetor. Uma imagem da amostra é assim obtida.

No modo de difração, uma abertura de área selecionada pode ser usada para determinar com mais precisão a área da amostra a partir da qual o sinal será exibido. Ao alterar a intensidade da corrente para a lente intermediária, o padrão de difração é projetado em uma tela. A difração é uma ferramenta muito poderosa para fazer uma reconstrução celular e determinação da orientação do cristal.

Formação de contraste

O contraste entre duas áreas adjacentes em uma imagem TEM pode ser definido como a diferença nas densidades de elétrons no plano da imagem. Devido ao espalhamento do feixe incidente pela amostra, a amplitude e a fase da onda de elétrons mudam, o que resulta em contraste de amplitude e contraste de fase , correspondentemente. A maioria das imagens possui ambos os componentes de contraste.

O contraste de amplitude é obtido devido à remoção de alguns elétrons antes do plano da imagem. Durante sua interação com a amostra, alguns elétrons serão perdidos devido à absorção, ou devido ao espalhamento em ângulos muito altos além da limitação física do microscópio, ou serão bloqueados pela abertura da objetiva. Enquanto as duas primeiras perdas são devido à construção do espécime e do microscópio, a abertura da objetiva pode ser usada pelo operador para aumentar o contraste.

Demonstração de contraste BF e DF. Imagem TEM de filme de Pt policristalino

A figura à direita mostra uma imagem TEM (a) e o padrão de difração correspondente (b) do filme policristalino de Pt tirado sem uma abertura objetiva. A fim de aumentar o contraste na imagem TEM, o número de feixes dispersos visíveis no padrão de difração deve ser reduzido. Isso pode ser feito selecionando uma determinada área no plano focal posterior, como apenas o feixe central ou um feixe difratado específico (ângulo), ou combinações de tais feixes. Selecionando intencionalmente uma abertura objetiva que só permite que o feixe não difratado passe além do plano focal posterior (e para o plano da imagem): cria-se uma imagem Bright-Field (BF) (c), enquanto se a imagem central, não o feixe difratado é bloqueado: pode-se obter imagens de campo escuro (DF), como as mostradas em (de). As imagens DF (de) foram obtidas selecionando os feixes difratados indicados no padrão de difração com círculos (b) usando uma abertura no plano focal posterior. Os grãos a partir dos quais os elétrons são espalhados nesses pontos de difração parecem mais brilhantes. Mais detalhes sobre a formação de contraste de difração são fornecidos mais adiante.

Existem dois tipos de contraste de amplitude - contraste de massa-espessura e difração. Primeiro, vamos considerar o contraste massa-espessura . Quando o feixe ilumina duas áreas vizinhas com baixa massa (ou espessura) e alta massa (ou espessura), a região mais pesada espalha elétrons em ângulos maiores. Esses elétrons fortemente dispersos são bloqueados no modo BF TEM pela abertura objetiva. Como resultado, as regiões mais pesadas aparecem mais escuras nas imagens BF (têm baixa intensidade). O contraste da espessura da massa é mais importante para materiais amorfos não cristalinos.

O contraste de difração ocorre devido a uma orientação cristalográfica específica de um grão. Nesse caso, o cristal está na chamada condição de Bragg, em que os planos atômicos são orientados de forma que haja uma alta probabilidade de espalhamento. Assim, o contraste de difração fornece informações sobre a orientação dos cristais em uma amostra policristalina. Observe que, caso exista contraste de difração, o contraste não pode ser interpretado como devido a variações de massa ou espessura.

Contraste de difração

Micrografia eletrônica de transmissão de deslocamentos no aço, que são falhas na estrutura da rede cristalina em escala atômica

As amostras podem apresentar contraste de difração, pelo qual o feixe de elétrons sofre espalhamento de Bragg , que, no caso de uma amostra cristalina, dispersa elétrons em locais discretos no plano focal posterior . Pela colocação de aberturas no plano focal posterior, ou seja, a abertura objetiva, as reflexões de Bragg desejadas podem ser selecionadas (ou excluídas), portanto, apenas partes da amostra que estão fazendo com que os elétrons se espalhem para as reflexões selecionadas acabarão projetadas sobre o aparelho de imagem.

Se as reflexões selecionadas não incluírem o feixe não espalhado (que aparecerá no ponto focal da lente), a imagem aparecerá escura sempre que não houver dispersão de amostra para o pico selecionado, como uma região sem amostra aparecerá escuro. Isso é conhecido como imagem de campo escuro.

TEMs modernos são frequentemente equipados com suportes de espécime que permitem ao usuário inclinar o espécime em uma gama de ângulos a fim de obter condições de difração específicas, e as aberturas colocadas acima do espécime permitem ao usuário selecionar elétrons que de outra forma seriam difratados em uma direção particular de entrar na amostra.

As aplicações para este método incluem a identificação de defeitos de rede em cristais. Selecionando cuidadosamente a orientação da amostra, é possível não apenas determinar a posição dos defeitos, mas também determinar o tipo de defeito presente. Se a amostra for orientada de modo que um plano particular seja apenas ligeiramente inclinado para longe do ângulo de difração mais forte (conhecido como Ângulo de Bragg ), qualquer distorção do plano do cristal que incline localmente o plano para o ângulo de Bragg produzirá variações de contraste particularmente fortes. No entanto, defeitos que produzem apenas deslocamento de átomos que não inclinam o cristal para o ângulo de Bragg (ou seja, deslocamentos paralelos ao plano do cristal) não produzirão contraste forte.

Contraste de fase

A estrutura do cristal também pode ser investigada por microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM), também conhecida como contraste de fase . Ao usar uma fonte de emissão de campo e um corpo de prova de espessura uniforme, as imagens são formadas devido às diferenças de fase das ondas eletrônicas, que são causadas pela interação do corpo de prova. A formação da imagem é dada pelo módulo complexo dos feixes de elétrons que chegam. Como tal, a imagem não depende apenas do número de elétrons que atingem a tela, tornando a interpretação direta das imagens de contraste de fase mais complexa. No entanto, esse efeito pode ser usado como uma vantagem, pois pode ser manipulado para fornecer mais informações sobre a amostra, como em técnicas de recuperação de fase complexa .

Difração

Padrão de difração cristalino de um grão geminado de aço austenítico FCC

Como afirmado anteriormente, ajustando as lentes magnéticas de modo que o plano focal posterior da lente em vez do plano de imagem seja colocado no aparelho de imagem, um padrão de difração pode ser gerado. Para amostras cristalinas finas, isso produz uma imagem que consiste em um padrão de pontos no caso de um único cristal, ou uma série de anéis no caso de um material sólido policristalino ou amorfo . Para o caso de cristal único, o padrão de difração depende da orientação da amostra e da estrutura da amostra iluminada pelo feixe de elétrons. Esta imagem fornece ao investigador informações sobre as simetrias do grupo espacial no cristal e a orientação do cristal em relação ao caminho do feixe. Isso normalmente é feito sem usar qualquer informação, mas a posição em que os pontos de difração aparecem e as simetrias da imagem observada.

Os padrões de difração podem ter uma grande faixa dinâmica e, para amostras cristalinas, podem ter intensidades maiores do que aquelas registradas pelo CCD. Dessa forma, os TEMs podem ainda ser equipados com cartuchos de filme para fins de obtenção dessas imagens, visto que o filme é um detector de uso único.

Linhas Kikuchi de feixe convergente de silício, perto do eixo da zona [100]

A análise dos padrões de difração além da posição do ponto pode ser complexa, pois a imagem é sensível a uma série de fatores, como espessura e orientação da amostra, desfoque da lente objetiva e aberração esférica e cromática. Embora a interpretação quantitativa do contraste mostrado nas imagens da rede seja possível, ela é intrinsecamente complicada e pode exigir simulação e análise de computador extensa, como a análise multislice de elétrons .

Um comportamento mais complexo no plano de difração também é possível, com fenômenos como linhas de Kikuchi surgindo de difração múltipla dentro da rede cristalina. Na difração de elétrons de feixe convergente (CBED), onde uma frente de onda de elétrons não paralela, ou seja, convergente, é produzida pela concentração do feixe de elétrons em uma sonda fina na superfície da amostra, a interação do feixe convergente pode fornecer informações além dos dados estruturais, como a amostra espessura.

Espectroscopia de perda de energia de elétrons (EELS)

Usando a técnica avançada de espectroscopia de perda de energia de elétrons (EELS), para TEMs devidamente equipados, os elétrons podem ser separados em um espectro com base em sua velocidade (que está intimamente relacionada à sua energia cinética e, portanto, a perda de energia da energia do feixe), usando dispositivos baseados em setor magnético conhecidos como espectrômetros EEL. Esses dispositivos permitem a seleção de valores de energia específicos, que podem ser associados à maneira como o elétron interagiu com a amostra. Por exemplo, diferentes elementos em uma amostra resultam em diferentes energias de elétrons no feixe após a amostra. Isso normalmente resulta em aberração cromática - no entanto, este efeito pode, por exemplo, ser usado para gerar uma imagem que fornece informações sobre a composição elementar, com base na transição atômica durante a interação elétron-elétron.

Os espectrômetros EELS geralmente podem ser operados nos modos espectroscópico e de imagem, permitindo o isolamento ou rejeição de feixes dispersos elasticamente . Como para muitas imagens, o espalhamento inelástico incluirá informações que podem não ser de interesse para o investigador, reduzindo assim os sinais observáveis ​​de interesse, a imagem EELS pode ser usada para aumentar o contraste nas imagens observadas, incluindo campo claro e difração, rejeitando componentes indesejados.

Imagem tridimensional

Uma imagem TEM tridimensional de um parapoxvírus

Como os suportes de amostra TEM normalmente permitem a rotação de uma amostra em um ângulo desejado, múltiplas vistas da mesma amostra podem ser obtidas girando o ângulo da amostra ao longo de um eixo perpendicular ao feixe. Ao tirar várias imagens de uma única amostra TEM em ângulos diferentes, normalmente em incrementos de 1 °, um conjunto de imagens conhecido como "série de inclinação" pode ser coletado. Essa metodologia foi proposta na década de 1970 por Walter Hoppe . Sob condições de contraste puramente de absorção, este conjunto de imagens pode ser usado para construir uma representação tridimensional da amostra.

A reconstrução é realizada por um processo de duas etapas, as primeiras imagens são alinhadas para dar conta dos erros no posicionamento de uma amostra; tais erros podem ocorrer devido a vibração ou deriva mecânica. Os métodos de alinhamento usam algoritmos de registro de imagem , como métodos de autocorrelação , para corrigir esses erros. Em segundo lugar, usando um algoritmo de reconstrução, como retroprojeção filtrada , as fatias de imagem alinhadas podem ser transformadas de um conjunto de imagens bidimensionais, I j ( xy ), em uma única imagem tridimensional, I ' j ( xyz ). Esta imagem tridimensional é de particular interesse quando a informação morfológica é necessária, um estudo mais aprofundado pode ser realizado usando algoritmos de computador, como isosuperfícies e divisão de dados para analisar os dados.

Como as amostras de TEM normalmente não podem ser vistas em uma rotação completa de 180 °, as imagens observadas normalmente sofrem de uma "cunha ausente" de dados, que ao usar métodos de retroprojeção baseados em Fourier diminui a faixa de frequências resolvíveis na reconstrução tridimensional. Refinamentos mecânicos, como inclinação multieixo (duas séries de inclinação do mesmo espécime feitas em direções ortogonais) e tomografia cônica (onde o espécime é primeiro inclinado para um determinado ângulo fixo e, em seguida, fotografado em incrementos rotacionais angulares iguais por meio de uma rotação completa em o plano da grade do espécime) pode ser usado para limitar o impacto dos dados ausentes na morfologia do espécime observado. Usando moagem de feixe de íons focado , uma nova técnica foi proposta que usa espécime em forma de pilar e um suporte de tomografia dedicado no eixo para realizar rotação de 180 ° da amostra dentro da peça polar da lente objetiva em TEM. Usando tais arranjos, a tomografia eletrônica quantitativa sem a cunha ausente é possível. Além disso, existem técnicas numéricas que podem melhorar os dados coletados.

Todos os métodos mencionados acima envolvem o registro de séries de inclinação de um determinado campo de amostra. Isso inevitavelmente resulta na soma de uma alta dose de elétrons reativos através da amostra e na destruição de detalhes finos durante o registro. A técnica de imagem de baixa dose (dose mínima) é, portanto, regularmente aplicada para mitigar esse efeito. A imagem de baixa dose é realizada desviando a iluminação e as regiões de imagem simultaneamente para longe do eixo óptico para criar a imagem de uma região adjacente à área a ser registrada (a região de alta dose). Esta área é mantida centralizada durante a inclinação e reorientada antes da gravação. Durante a gravação, as deflexões são removidas de modo que a área de interesse seja exposta ao feixe de elétrons apenas durante o tempo necessário para a geração de imagens. Uma melhoria desta técnica (para objetos descansando em um filme de substrato inclinado) é ter duas regiões simétricas fora do eixo para focagem, seguidas por definir o foco para a média dos dois valores de foco de alta dose antes de registrar a área de baixa dose de interesse .

Variantes não tomográficas desse método, conhecidas como análise de partícula única , usam imagens de vários objetos (esperançosamente) idênticos em diferentes orientações para produzir os dados de imagem necessários para a reconstrução tridimensional. Se os objetos não têm orientações preferenciais significativas, este método não sofre da cunha de dados ausente (ou cone) que acompanha os métodos tomográficos, nem incorre em dosagem de radiação excessiva, no entanto, assume que os diferentes objetos fotografados podem ser tratados como se o Os dados 3D gerados a partir deles surgiram de um único objeto estável.

Preparação de amostra

Uma amostra de células (preto) corada com tetróxido de ósmio e acetato de uranila embebida em resina epóxi (âmbar) pronta para corte.

A preparação da amostra em TEM pode ser um procedimento complexo. Os espécimes de TEM devem ter menos de 100 nanômetros de espessura para um TEM convencional. Ao contrário da radiação de nêutrons ou raios-X, os elétrons no feixe interagem prontamente com a amostra, um efeito que aumenta aproximadamente com o número atômico ao quadrado (Z 2 ). Amostras de alta qualidade terão uma espessura comparável ao caminho livre médio dos elétrons que viajam através das amostras, que pode ser de apenas algumas dezenas de nanômetros. A preparação das amostras TEM é específica para o material em análise e o tipo de informação a ser obtida da amostra.

Materiais que têm dimensões pequenas o suficiente para serem transparentes aos elétrons, como substâncias em pó, pequenos organismos, vírus ou nanotubos, podem ser rapidamente preparados pela deposição de uma amostra diluída contendo a amostra em filmes em grades de suporte. Os espécimes biológicos podem ser incorporados em resina para suportar o alto vácuo na câmara de amostra e para permitir o corte de tecido em seções finas transparentes de elétrons. A amostra biológica pode ser corada usando um material de coloração negativa , como acetato de uranila para bactérias e vírus, ou, no caso de seções incorporadas, a amostra pode ser corada com metais pesados, incluindo tetróxido de ósmio . Alternativamente, as amostras podem ser mantidas em temperaturas de nitrogênio líquido após a incorporação em gelo vítreo. Em ciência dos materiais e metalurgia, os espécimes geralmente podem suportar o alto vácuo, mas ainda devem ser preparados como uma folha fina ou gravada de forma que alguma parte do espécime seja fina o suficiente para o feixe penetrar. Restrições na espessura do material podem ser limitadas pela seção transversal de espalhamento dos átomos dos quais o material é composto.

Seccionamento de tecido

Lâmina de faca de diamante usada para cortar seções ultrafinas (normalmente 70 a 350 nm) para microscopia eletrônica de transmissão.

O tecido biológico é frequentemente incorporado em um bloco de resina e, em seguida, diluído para menos de 100 nm em um ultramicrótomo . O bloco de resina é fraturado ao passar sobre o fio de uma faca de vidro ou diamante. Este método é usado para obter amostras finas e minimamente deformadas que permitem a observação da ultraestrutura do tecido. Amostras inorgânicas, como alumínio, também podem ser incorporadas em resinas e seccionadas ultrafinas desta forma, usando vidro revestido, safira ou facas de diamante de ângulo maior. Para evitar o acúmulo de carga na superfície da amostra durante a visualização no TEM, as amostras de tecido precisam ser revestidas com uma fina camada de material condutor, como carbono.

Coloração de amostra

Uma seção de uma célula de Bacillus subtilis , tirada com um Tecnai T-12 TEM. A barra de escala é de 200 nm.

Amostras TEM de tecidos biológicos precisam de manchas de alto número atômico para aumentar o contraste. A mancha absorve os elétrons do feixe ou espalha parte do feixe de elétrons que, de outra forma, é projetada no sistema de imagem. Compostos de metais pesados, tais como ósmio , chumbo , urânio ou ouro (na marcação imunogold ) podem ser usados ​​antes da observação TEM para depositar seletivamente átomos densos de elétrons em ou sobre a amostra na região celular ou proteica desejada. Este processo requer uma compreensão de como os metais pesados ​​se ligam a tecidos biológicos específicos e estruturas celulares.

Fresagem mecânica

O polimento mecânico também é usado para preparar amostras para geração de imagens no TEM. O polimento deve ser feito com alta qualidade, para garantir a espessura constante da amostra em toda a região de interesse. Um diamante ou composto de polimento de nitreto de boro cúbico pode ser usado nos estágios finais de polimento para remover quaisquer riscos que possam causar flutuações de contraste devido à variação da espessura da amostra. Mesmo após um fresamento mecânico cuidadoso, métodos finos adicionais, como corrosão iônica, podem ser necessários para realizar o desbaste do estágio final.

Gravura Química

Certas amostras podem ser preparadas por corrosão química, particularmente amostras metálicas. Essas amostras são diluídas usando um agente de corrosão químico, como um ácido, para preparar a amostra para observação TEM. Dispositivos para controlar o processo de diluição podem permitir que o operador controle a tensão ou a corrente que passa através da amostra e podem incluir sistemas para detectar quando a amostra foi diluída a um nível suficiente de transparência óptica.

Gravura de íons

A corrosão iônica é um processo de pulverização catódica que pode remover quantidades muito pequenas de material. Isso é usado para executar um polimento de acabamento de amostras polidas por outros meios. A corrosão iônica usa um gás inerte que passa por um campo elétrico para gerar uma corrente de plasma que é direcionada para a superfície da amostra. As energias de aceleração para gases como o argônio são normalmente de alguns quilovolts. A amostra pode ser girada para promover o polimento uniforme da superfície da amostra. A taxa de pulverização catódica de tais métodos é da ordem de dezenas de micrômetros por hora, limitando o método a apenas um polimento extremamente fino.

A corrosão iônica por gás argônio foi recentemente demonstrada ser capaz de arquivar estruturas de pilha MTJ para uma camada específica que foi então atomicamente resolvida. As imagens TEM obtidas em vista plana, em vez de seção transversal, revelam que a camada de MgO dentro de MTJs contém um grande número de limites de grãos que podem estar diminuindo as propriedades dos dispositivos.

Moagem de íons

Imagem do microscópio eletrônico de varredura de uma amostra fina de TEM moída por FIB . A membrana fina mostrada aqui é adequada para exame TEM; no entanto, em ~ 300 nm de espessura, não seria adequado para TEM de alta resolução sem moagem adicional.

Mais recentemente, métodos de feixe de íons focalizados têm sido usados ​​para preparar amostras. FIB é uma técnica relativamente nova para preparar amostras finas para o exame TEM de espécimes maiores. Como o FIB pode ser usado para micromáquinas de amostras com muita precisão, é possível fresar membranas muito finas de uma área específica de interesse em uma amostra, como um semicondutor ou metal. Ao contrário da pulverização catódica de gás inerte, o FIB faz uso de íons de gálio significativamente mais energéticos e pode alterar a composição ou estrutura do material por meio da implantação de gálio.

Transferência assistida por nanowire

Para uma introdução mínima de estresse e flexão para amostras de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ( lamelas , filmes finos e outras amostras sensíveis ao feixe e mecanicamente), ao transferir dentro de um feixe de íons focado (FIB), nanofios metálicos flexíveis podem ser anexados a um micromanipulador tipicamente rígido .

As principais vantagens deste método incluem uma redução significativa do tempo de preparação da amostra (soldagem rápida e corte de nanofio na corrente de feixe baixo) e minimização de flexão induzida por tensão, contaminação de Pt e danos ao feixe de íons. Esta técnica é particularmente adequada para a preparação de amostras de microscopia eletrônica in situ .

Replicação

Imagem de réplica de platina de Staphylococcus aureus capturada em um TEM com ampliação de 50.000x.

As amostras também podem ser replicadas usando filme de acetato de celulose , o filme subsequentemente revestido com um metal pesado, como platina, o filme original dissolvido e a imagem da réplica no TEM. Variações da técnica de réplica são usadas para materiais e amostras biológicas. Na ciência dos materiais, um uso comum é examinar a superfície de fratura recente de ligas metálicas.

Modificações

As capacidades do TEM podem ser estendidas por estágios e detectores adicionais, às vezes incorporados no mesmo microscópio.

Scanning TEM

Um TEM pode ser modificado em um microscópio eletrônico de transmissão de varredura (STEM) pela adição de um sistema que rasta um feixe convergente através da amostra para formar a imagem, quando combinado com detectores adequados. As bobinas de varredura são usadas para desviar o feixe, como por um deslocamento eletrostático do feixe, onde o feixe é então coletado usando um detector de corrente, como um copo de Faraday , que atua como um contador direto de elétrons. Ao correlacionar a contagem de elétrons com a posição do feixe de varredura (conhecido como "sonda"), o componente transmitido do feixe pode ser medido. Os componentes não transmitidos podem ser obtidos por inclinação do feixe ou pelo uso de detectores de campo escuro anulares .

Diagrama de raio esquemático ilustrando a reciprocidade óptica entre TEM (esquerda) e STEM (direita). O ângulo de convergência em TEM,, torna-se o ângulo de coleta em STEM ,. Imagem inspirada em Hren et al.

Fundamentalmente, TEM e STEM estão vinculados por meio de reciprocidade de Helmholtz . Um STEM é um TEM no qual a fonte de elétrons e o ponto de observação foram trocados em relação à direção de deslocamento do feixe de elétrons. Veja os diagramas de raios na figura à direita. O instrumento STEM confia efetivamente na mesma configuração óptica de um TEM, mas opera invertendo a direção do percurso dos elétrons (ou invertendo o tempo) durante a operação de um TEM. Em vez de usar uma abertura para controlar os elétrons detectados, como no TEM, um STEM usa vários detectores com ângulos de coleta que podem ser ajustados dependendo de quais elétrons o usuário deseja capturar.

Microscópio eletrônico de baixa voltagem

Um microscópio eletrônico de baixa voltagem (LVEM) é operado em uma voltagem de aceleração de elétrons relativamente baixa entre 5–25 kV. Alguns deles podem ser uma combinação de SEM, TEM e STEM em um único instrumento compacto. A baixa voltagem aumenta o contraste da imagem, o que é especialmente importante para espécimes biológicos. Este aumento de contraste reduz significativamente, ou mesmo elimina a necessidade de manchar. Resoluções de alguns nm são possíveis nos modos TEM, SEM e STEM. A baixa energia do feixe de elétrons significa que ímãs permanentes podem ser usados ​​como lentes e, portanto, uma coluna em miniatura que não requer resfriamento pode ser usada.

Cryo-TEM

Artigo principal: Criomicroscopia eletrônica de transmissão

A microscopia eletrônica de transmissão criogênica (Cryo-TEM) usa um TEM com um suporte de amostra capaz de manter a amostra em temperaturas de nitrogênio líquido ou hélio líquido . Isso permite a imagem de espécimes preparados em gelo vítreo , a técnica de preparação preferida para a imagem de moléculas individuais ou conjuntos macromoleculares , a imagem de interfaces de eletrólito sólido vitrificado e a imagem de materiais que são voláteis em alto vácuo à temperatura ambiente, como o enxofre.

TEM ambiental / in-situ

Os experimentos in situ também podem ser conduzidos em TEM usando câmaras de amostras bombeadas diferencialmente ou suportes especializados. Os tipos de experimentos in situ incluem o estudo de nanomateriais, espécimes biológicos e reações químicas usando microscopia eletrônica de fase líquida e teste de deformação de material.

TEM corrigido de aberração

TEMs de pesquisa moderna podem incluir corretores de aberração , para reduzir a quantidade de distorção na imagem. Monocromadores de feixe incidente também podem ser usados, o que reduz a propagação de energia do feixe de elétrons incidente para menos de 0,15  eV . Os principais fabricantes de TEM com correção de aberração incluem JEOL , Hitachi High-technologies, FEI Company e NION.

TEM ultrarrápido e dinâmico

É possível alcançar uma resolução temporal muito além da taxa de leitura de detectores de elétrons com o uso de elétrons pulsados . Os pulsos podem ser produzidos pela modificação da fonte de elétrons para permitir a fotoemissão disparada por laser ou pela instalação de um redutor de feixe ultrarrápido. Esta abordagem é denominada microscopia eletrônica de transmissão ultrarrápida quando a iluminação estroboscópica da bomba-sonda é usada: uma imagem é formada pelo acúmulo de muitos pulsos de elétrons com um atraso de tempo fixo entre a chegada do pulso de elétrons e a excitação da amostra. Por outro lado, o uso de pulsos de elétrons em uma ou uma sequência curta com um número suficiente de elétrons para formar uma imagem de cada pulso é denominado microscopia eletrônica de transmissão dinâmica. Resolução temporal de até centenas de femtossegundos e resolução espacial comparável àquela disponível com uma fonte de emissão de campo Schottky é possível em TEM ultrarrápido, mas a técnica só pode gerar imagens de processos reversíveis que podem ser reproduzidos milhões de vezes. TEM dinâmico pode resolver processos irreversíveis até dezenas de nanossegundos e dezenas de nanômetros.

Limitações

Existem várias desvantagens na técnica TEM. Muitos materiais requerem preparação extensiva de amostra para produzir uma amostra fina o suficiente para ser transparente aos elétrons, o que torna a análise de TEM um processo relativamente demorado com um baixo rendimento de amostras. A estrutura da amostra também pode ser alterada durante o processo de preparação. Além disso, o campo de visão é relativamente pequeno, levantando a possibilidade de que a região analisada pode não ser característica de toda a amostra. É possível que a amostra seja danificada pelo feixe de elétrons, principalmente no caso de materiais biológicos.

Limites de resolução

Evolução da resolução espacial alcançada com microscópios ópticos, de transmissão (TEM) e microscópios eletrônicos com correção de aberração (ACTEM).

O limite de resolução obtido em um TEM pode ser descrito de várias maneiras e é normalmente referido como o limite de informação do microscópio. Um valor comumente usado é um valor de corte da função de transferência de contraste , uma função que normalmente é citada no domínio da frequência para definir a reprodução de frequências espaciais de objetos no plano do objeto pela ótica do microscópio. Uma frequência de corte, q max , para a função de transferência pode ser aproximada com a seguinte equação, onde C s é o coeficiente de aberração esférica e λ é o comprimento de onda do elétron:

Para um microscópio de 200 kV, com aberrações esféricas parcialmente corrigidas ("para a terceira ordem") e um valor C s de 1 µm, um valor de corte teórico pode ser 1 / q máx = 42  pm . O mesmo microscópio sem um corretor teria C s = 0,5 mm e, portanto, um corte de 200 pm. As aberrações esféricas são suprimidas na terceira ou quinta ordem nos microscópios com " correção de aberração ". Sua resolução é, no entanto, limitada pela geometria da fonte de elétrons e brilho e aberrações cromáticas no sistema de lentes objetivas.

A representação do domínio de frequência da função de transferência de contraste pode frequentemente ter uma natureza oscilatória, que pode ser ajustada ajustando o valor focal da lente objetiva. Esta natureza oscilatória implica que algumas frequências espaciais são fielmente reproduzidas pelo microscópio, enquanto outras são suprimidas. Ao combinar várias imagens com diferentes frequências espaciais, o uso de técnicas como a reconstrução da série focal pode ser usado para melhorar a resolução do TEM de uma maneira limitada. A função de transferência de contraste pode, até certo ponto, ser experimentalmente aproximada por meio de técnicas como a transformação de Fourier de imagens de material amorfo, como o carbono amorfo .

Mais recentemente, os avanços no design do corretor de aberração têm sido capazes de reduzir as aberrações esféricas e alcançar resolução abaixo de 0,5 Ångströms (50 pm) em ampliações acima de 50 milhões de vezes. A resolução melhorada permite a geração de imagens de átomos mais leves que espalham elétrons com menos eficiência, como átomos de lítio em materiais de bateria de lítio. A capacidade de determinar a posição dos átomos dentro dos materiais tornou o HRTEM uma ferramenta indispensável para a pesquisa e o desenvolvimento da nanotecnologia em muitos campos, incluindo catálise heterogênea e o desenvolvimento de dispositivos semicondutores para eletrônica e fotônica.

Veja também

Referências

links externos