Perfusão de máquina - Machine perfusion

A perfusão mecânica (MP) é uma técnica utilizada no transplante de órgãos como meio de preservação dos órgãos a serem transplantados.

A perfusão mecânica tem várias formas e pode ser categorizada de acordo com a temperatura do perfusato: fria (4 ° C) e quente (37 ° C). Perfusão mecânica tem sido aplicada ao transplante renal , transplante de fígado e transplante de pulmão . É uma alternativa ao armazenamento refrigerado estático (SCS).

História das técnicas de preservação renal

Diagrama de perfusão regional normotérmica de preparação de órgãos abdominais para transplante

Uma preliminar essencial para o desenvolvimento de armazenamento e transplante de rim foi o trabalho de Alexis Carrel no desenvolvimento de métodos para anastomose vascular . Carrel passou a descrever os primeiros transplantes renais, realizados em cães em 1902; Ullman descreveu experiências semelhantes de forma independente no mesmo ano. Nestes experimentos os rins foram transplantados sem que houvesse qualquer tentativa de armazenamento.

O passo crucial para tornar possível o armazenamento in vitro de rins foi a demonstração, por Fuhrman, em 1943, de um efeito reversível da hipotermia sobre os processos metabólicos de tecidos isolados. Antes disso, os rins eram armazenados em temperaturas corporais normais usando sangue ou perfusatos sanguíneos diluídos, mas nenhum reimplante bem-sucedido foi feito. Fuhrman mostrou que fatias do córtex renal e do cérebro de ratos resistiram ao resfriamento a 0,2 ° C por uma hora, temperatura à qual seu consumo de oxigênio era mínimo. Quando as fatias foram reaquecidas a 37 ° C, o consumo de oxigênio voltou ao normal.

O efeito benéfico da hipotermia em rins isquêmicos intactos foi demonstrado por Owens em 1955 quando ele mostrou que, se os cães fossem resfriados a 23-26 ° C e suas aortas torácicas estivessem ocluídas por 2 horas, seus rins não apresentariam danos aparentes quando os cães foram reaquecidos. Este efeito protetor da hipotermia sobre o dano isquêmico renal foi confirmado por Bogardus, que mostrou um efeito protetor do resfriamento da superfície dos rins de cães cujos pedículos renais foram pinçados in situ por 2 horas. Moyer demonstrou a aplicabilidade desses experimentos com cães para humanos, mostrando o mesmo efeito na função renal de cães e humanos nos mesmos períodos de isquemia hipotérmica.

Somente em 1958 foi demonstrado que rins de cães intactos sobreviveriam à isquemia ainda melhor se fossem resfriados a temperaturas mais baixas. Stueber mostrou que os rins sobreviveriam ao clampeamento in situ do pedículo renal por 6 horas se os rins fossem resfriados a 0-5 ° C sendo colocados em uma jaqueta de resfriamento, e Schloerb mostrou que uma técnica semelhante com resfriamento de rins de cães heparinizados a 2 -4 ° C deu proteção por 8 horas, mas não 12 horas. Schloerb também tentou o armazenamento in vitro e o autotransplante de rins resfriados, e teve um sobrevivente de longo prazo após armazenamento renal de 4 horas seguido de reimplante e nefrectomia contralateral imediata . Ele também teve um quase sobrevivente, após armazenamento renal de 24 horas e nefrectomia contralateral tardia, em um cão que desenvolveu uma trombose arterial tardia no rim.

Esses métodos de resfriamento da superfície foram aprimorados com a introdução de técnicas nas quais o sistema vascular do rim era lavado com fluido frio antes do armazenamento. Isso teve o efeito de aumentar a velocidade de resfriamento do rim e remover os glóbulos vermelhos do sistema vascular. Kiser usou esta técnica para alcançar o armazenamento in vitro de 7 horas de sucesso de um rim de cão, quando o rim foi lavado a 5 ° C com uma mistura de dextrano e sangue diluído antes do armazenamento. Em 1960, Lapchinsky confirmou que períodos de armazenamento semelhantes eram possíveis, quando relatou que oito cães sobreviveram após seus rins terem sido armazenados a 2-4 ° C por 28 horas, seguido por autotransplante e nefrectomia contralateral tardia. Embora Lapchinsky não tenha dado detalhes em seu artigo, Humphries relatou que esses experimentos envolveram o resfriamento dos rins por 1 hora com sangue frio e, em seguida, armazenamento a 2-4 ° C, seguido de reaquecimento dos rins por 1 hora com sangue quente no momento do reimplante. As nefrectomias contralaterais foram postergadas por dois meses.

Humphries desenvolveu essa técnica de armazenamento perfundindo continuamente o rim durante todo o período de armazenamento. Ele usou plasma ou soro diluído como perfusato e apontou a necessidade de baixas pressões do perfusato para prevenir o edema renal, mas admitiu que os valores ótimos para variáveis ​​como temperatura do perfusato, Po 2 e fluxo permanecem desconhecidos. Seus melhores resultados, neste momento, foram 2 cães que sobreviveram após terem seus rins armazenados por 24 horas a 4-10 ° C, seguido por autotransplante e nefrectomia contralateral retardada algumas semanas depois.

Calne desafiou a necessidade de usar métodos de perfusão contínua, demonstrando que a preservação de 12 horas com sucesso poderia ser alcançada usando técnicas muito mais simples. Calne tinha um rim que sustentava a vida, mesmo quando a nefrectomia contralateral foi realizada ao mesmo tempo que a operação de reimplante. Calne apenas heparinizou rins de cães e depois os armazenou em solução gelada a 4 ° C. Embora a preservação de 17 horas tenha se mostrado possível em um experimento quando a nefrectomia foi adiada, nenhum sucesso foi alcançado com o armazenamento de 24 horas.

O próximo avanço foi feito por Humphries em 1964, quando ele modificou o perfusato usado em seu sistema de perfusão contínua original, e tinha um rim de cão capaz de suportar a vida após armazenamento de 24 horas, mesmo quando uma nefrectomia contralateral imediata foi realizada ao mesmo tempo como o reimplante. Nestes experimentos, sangue autógeno, diluído a 50% com solução de Tis-U-Sol a 10 ° C, foi usado como perfusato. A pressão do perfusato era de 40 mm Hg e o perfusato pH 7,11-7,35 (a 37 ° C). Um pulmão de membrana foi usado para oxigenação para evitar danos ao sangue.

Na tentativa de melhorar esses resultados, Manax investigou o efeito do oxigênio hiperbárico e descobriu que o armazenamento bem-sucedido de rins de cães por 48 horas era possível a 2 ° C sem o uso de perfusão contínua, quando os rins eram lavados com um dextran / Tis-U- Solução Sol antes do armazenamento à pressão de 7,9 atmosferas e se a nefrectomia contralateral foi adiada até 2 a 4 semanas após o reimplante. Manax postulou que o oxigênio hiperbárico pode funcionar inibindo o metabolismo ou auxiliando na difusão do oxigênio nas células renais, mas ele não relatou experimentos de controle para determinar se outros aspectos de seu modelo eram mais importantes do que a hiperbária.

Uma melhora acentuada nos tempos de armazenamento foi alcançada por Belzer em 1967 quando ele relatou armazenamento renal de 72 horas com sucesso após retornar ao uso de perfusão contínua usando um perfusato baseado em plasma canino a 8-12 ° C. Belzer descobriu que o fator crucial para permitir a perfusão não complicada de 72 horas era a crioprecipitação do plasma usado no perfusato para reduzir a quantidade de lipo-proteínas instáveis ​​que, de outra forma, precipitariam da solução e obstruiriam progressivamente o sistema vascular do rim. Um oxigenador de membrana também foi usado no sistema em uma tentativa posterior de evitar a desnaturação das lipoproteínas, pois apenas 35% das lipoproteínas foram removidas por criocipitação. O perfusato era composto por 1 litro de plasma canino, 4 mEq de sulfato de magnésio, 250 ml de dextrose, 80 unidades de insulina, 200.000 unidades de penicilina e 100 mg de hidrocortisona. Além de ser crioprecipitado , o perfusato foi pré-filtrado através de um filtro de 0,22 mícrons imediatamente antes do uso. Belzer usou um perfusato de pH de 7,4-7,5, um Po 2 de 150–190 mm Hg e uma pressão de perfusato sistólica de 50–80 mm Hg em uma máquina que produziu um fluxo pulsátil de perfusato. Usando este sistema, Belzer teve 6 cães sobreviventes após seus rins terem sido armazenados por 72 horas e então reimplantados, com nefrectomias contralaterais imediatas sendo realizadas nas operações de reimplante.

O uso de hidrocortisona como adjuvante de preservação por Belzer foi sugerido pelo trabalho de Lotke com fatias de rim de cães, em que a hidrocortisona melhorou a capacidade das fatias de excretar PAH e oxigênio após 30 horas de armazenamento a 2-4 ° C; Lotke sugeriu que a hidrocortisona pode estar agindo como um estabilizador da membrana lisossomal nesses experimentos. Os outros componentes do modelo de Belzer foram obtidos empiricamente. A insulina e o magnésio foram usados ​​parcialmente na tentativa de induzir a hibernação artificial , pois Suomalainen descobriu que esse regime era eficaz na indução da hibernação em hibernadores naturais. O magnésio também foi fornecido como um inibidor metabólico após a demonstração de Kamiyama de que era um agente eficaz na preservação do coração de um cão. Uma outra justificativa para o magnésio era que ele era necessário para substituir o cálcio que havia sido ligado pelo citrato no plasma .

Belzer demonstrou a aplicabilidade de seus experimentos com cães para o armazenamento de rins humanos quando relatou suas experiências no transplante renal humano usando as mesmas técnicas de armazenamento que usou para rins de cães. Ele foi capaz de armazenar rins por até 50 horas com apenas 8% dos pacientes necessitando de diálise pós-operatória quando o doador estava bem preparado.

Em 1968, Humphries relatou 1 sobrevivente em 14 cães após 5 dias de armazenamento de seus rins em uma máquina de perfusão a 10 ° C, usando um meio de plasma diluído contendo ácidos graxos extras. No entanto, a nefrectomia contralateral retardada 4 semanas após o reimplante foi necessária nestes experimentos para alcançar o sucesso, e isso indicou que os rins foram gravemente feridos durante o armazenamento.

Em 1969, Collins relatou uma melhora nos resultados que poderiam ser alcançados com métodos simples de não perfusão de armazenamento renal hipotérmico. Ele baseou sua técnica na observação de Keller de que a perda de eletrólitos de um rim durante o armazenamento poderia ser evitada pelo uso de um fluido de armazenamento contendo cátions em quantidades próximas às normalmente presentes nas células. No modelo de Collins, os cães estavam bem hidratados antes da nefrectomia e também receberam manitol para induzir a diurese. Fenoxibenzamina, um vasodilatador e estabilizador da enzima lisozomal, foi injetada na artéria renal antes da nefrectomia. Os rins foram imersos em solução salina imediatamente após a remoção e perfundidos através da artéria renal com 100-150 ml de uma solução eletrolítica fria de uma altura de 100 cm. Os rins permaneceram em solução salina gelada pelo resto do período de armazenamento. A solução usada para essas perfusões frias bem-sucedidas imitou a composição eletrolítica dos fluidos intracelulares por conter grandes quantidades de potássio e magnésio. A solução também continha glicose, heparina, procaína e fenoxibenzamina. O pH da solução era de 7,0 a 25 ° C. Collins foi capaz de obter armazenamento de 24 horas de 6 rins com sucesso e armazenamento de 3 rins por 30 horas, com os rins funcionando imediatamente após o reimplante, apesar das nefrectomias contralaterais imediatas. Collins enfatizou os resultados ruins obtidos com um enxágue com solução de Ringer, ao encontrar resultados semelhantes com esse tratamento quando comparados aos rins tratados apenas com resfriamento de superfície. Liu relatou que a solução de Collins poderia fornecer um armazenamento bem-sucedido de 48 horas quando a solução fosse modificada pela inclusão de aminoácidos e vitaminas. No entanto, Liu não realizou experimentos de controle para mostrar que essas modificações eram cruciais.

Outros pesquisadores encontraram dificuldade em repetir os experimentos de armazenamento de perfusão de 72 horas bem-sucedidos de Belzer. Woods foi capaz de alcançar o armazenamento de 48 horas de sucesso de 3 de 6 rins quando ele usou os aditivos Belzer com plasma crioprecipitado como o perfusato em um sistema de perfusão hipotérmico, mas ele não foi capaz de estender o tempo de armazenamento para 72 horas como Belzer havia feito . No entanto, Woods mais tarde obteve sucesso no armazenamento de rins de cães por 3 e 7 dias. Woods modificou o perfusato de Belzer pela adição de 250 mg de metil prednisolona, ​​aumentou o teor de sulfato de magnésio para 16,2 mEq e a insulina para 320 unidades. Seis dos 6 rins produziram função de sustentação da vida quando foram reimplantados após 72 horas de armazenamento, apesar das nefrectomias contralaterais imediatas; 1 de 2 rins produziram função de sustentação da vida após 96 horas de armazenamento, 1 de 2 após 120 horas de armazenamento e 1 de 2 após 168 horas de armazenamento. A pressão do perfusato era de 60 mm Hg com uma taxa de bomba do perfusato de 70 batimentos por minuto, e o pH do perfusato foi automaticamente mantido em 7,4 por um titulador de CO 2 . Woods enfatizou a importância da hidratação dos animais doadores e receptores. Sem a metil prednisolona, ​​Woods descobriu que a fragilidade dos vasos era um problema quando o tempo de armazenamento era superior a 48 horas.

Uma grande simplificação das técnicas de armazenamento de perfusão hipotérmica foi feita por Johnson e Claes em 1972 com a introdução de um perfusato à base de albumina. Este perfusato eliminou a necessidade de fabricação do plasma crioprecipitado e filtrado por millipore utilizado pela Belzer. A preparação desse perfusato foi trabalhosa e demorada, e havia o risco potencial de vírus da hepatite e anticorpos citotóxicos. A ausência de lipo-proteínas do perfusato significava que o oxigenador de membrana poderia ser eliminado do circuito de perfusão, pois não havia necessidade de evitar a interface perfusato / ar para evitar a precipitação de lipo-proteínas. Ambos os trabalhadores usaram os mesmos aditivos recomendados por Belzer.

A solução que Johnson usou foi preparada pelo Laboratório de Produtos de Sangue (Elstree: Inglaterra) extraindo fibrinogênio termolábil e gamaglobulinas do plasma para dar uma solução de fração de proteína plasmática (PPF). A solução foi incubada a 60 ° C por 10 horas para inativar o agente da hepatite sérica. O resultado foi uma solução de albumina humana de 45 g / l contendo pequenas quantidades de gama e beta globulinas que se manteve estável entre 0 ° C e 30 ° C por 5 anos. PPF continha 2,2 mmol / l de ácidos graxos livres.

Os experimentos de Johnson estavam preocupados principalmente com o armazenamento de rins que haviam sido danificados por ferimentos de calor prolongados. No entanto, em um grupo de controle de rins de cães feridos não quentes, Johnson mostrou que a preservação de 24 horas foi facilmente alcançada com o uso de um perfusato de PPF e descreveu em outro lugar um sobrevivente após perfusão de 72 horas e reimplante com nefrectomia contralateral imediata. Com rins lesionados quentes, a perfusão PPF deu melhores resultados do que o método de Collins, com 6 de 6 cães sobrevivendo após lesão quente de 40 minutos e armazenamento de 24 horas seguido de reimplante dos rins e nefrectomia contralateral imediata. Potássio, magnésio, insulina, glicose, hidrocortisona e ampicilina foram adicionados à solução de PPF para fornecer uma fonte de energia e evitar vazamento de potássio intracelular. A temperatura do perfusato era de 6 ° C, pressão de 40–80 mm Hg e Po 2 200–400 mm Hg. O pH foi mantido entre 7,2 e 7,4.

Claes usou um perfusato à base de albumina humana (Kabi: Suécia) diluído com soro fisiológico a uma concentração de 45 g / l. Claes preservou 4 de 5 rins de cães por 96 horas com os rins funcionando imediatamente após o reimplante, apesar das nefrectomias contralaterais imediatas. Claes também comparou este perfusato com o plasma crioprecipitado de Belzer em um grupo controle e não encontrou nenhuma diferença significativa entre a função dos rins reimplantados nos dois grupos.

O único outro grupo além de Woods a relatar o armazenamento bem-sucedido de rins por sete dias foi Liu e Humphries em 1973. Eles tiveram três de sete cães sobreviventes, após seus rins terem sido armazenados por sete dias seguidos de reimplante e nefrectomia contralateral imediata. Seu melhor cão teve um pico de creatinina pós-reimplante de 50 mg / l (0,44 mmol / l). Liu usou cães bem hidratados submetidos a diurese de manitol e armazenou os rins a 9 ° C - 10 ° C usando um perfusato derivado de PPF humano. O PPF foi ainda fracionado usando um polímero altamente solúvel em água (Pluronic F-38), e acetil triptofanato de sódio e caprilato de sódio foram adicionados ao PPF como estabilizadores para permitir a pasteurização. A esta solução foram adicionados albumina humana, heparina, manitol, glicose, sulfato de magnésio, cloreto de potássio, insulina, metil prednisolona, ​​carbenicilina e água para ajustar a osmolalidade para 300-310  mosmol / kg. O perfusato foi trocado após 3,5 dias de armazenamento. A pressão do perfusato era de 60 mm Hg ou menos, a uma taxa de bombeamento de 60 por minuto. O pH do perfusato era de 7,12–7,32 (a 37 ° C), Pco2 27–47 mm Hg e Po 2 173–219 mm Hg. Em um relatório adicional sobre este estudo, Humphries descobriu que quando os experimentos foram repetidos com um novo lote de PPF nenhum sobrevivente foi obtido, e a histologia dos sobreviventes do experimento original mostrou hipercelularidade glomerular que ele atribuiu a um possível efeito tóxico do polímero Pluronic .

Joyce e Proctor relataram o uso bem-sucedido de um perfusato simples à base de dextrana para armazenamento de rins de cães por 72 horas. 10 de 17 rins eram viáveis ​​após o reimplante e nefrectomia contralateral imediata. Joyce utilizou perfusão não pulsátil a 4 ° C com perfusato contendo Dextran 70 (Pharmacia) 2,1%, com eletrólitos adicionais, glicose (19,5 g / l), procaína e hidrocortisona. O perfusato não continha plasma ou componentes de plasma. A pressão do perfusato era de apenas 30 cm H 2 O, pH 7,34-7,40 e Po 2 250-400 mm Hg. Este trabalho mostrou que, para armazenamento de 72 horas, nenhum outro nutriente além da glicose era necessário, e as pressões e fluxos de perfusato baixos eram adequados.

Em 1973, Sacks mostrou que o armazenamento simples de gelo poderia ser usado com sucesso para um armazenamento de 72 horas, quando uma nova solução de lavagem era usada para o resfriamento inicial e lavagem do rim. Sacos removeram rins de cães bem hidratados que estavam em diurecimento após infusão de manitol e irrigaram os rins com 200 ml de solução de uma altura de 100 cm. Os rins foram então simplesmente mantidos a 2 ° C por 72 horas sem perfusão adicional. O reimplante foi seguido por nefrectomias contralaterais imediatas. A solução de descarga foi projetada para imitar a composição do fluido intracelular e continha manitol como um íon impermeável para prevenir ainda mais o inchaço celular. A osmolalidade da solução era de 430 mosmol / kg e seu pH de 7,0 a 2 ° C. Os aditivos usados ​​por Collins (dextrose, fenoxibenzamina, procaína e heparina) foram omitidos por Sacks.

Esses resultados foram igualados por Ross, que também obteve sucesso no armazenamento de 72 horas sem o uso de perfusão contínua, embora ele tenha sido incapaz de reproduzir os resultados de Collins ou Sacks usando as soluções originais de Collins ou Sacks. A solução bem-sucedida de Ross foi semelhante em composição eletrolítica ao fluido intracelular com a adição de citrato hipertônico e manitol. Nenhum fosfato, bicarbonato, cloreto ou glicose estavam presentes na solução; a osmolalidade foi de 400 mosmol / kg e o pH 7,1. Cinco dos 8 cães sobreviveram ao reimplante de seus rins e à nefrectomia contralateral imediata, quando os rins foram armazenados por 72 horas após terem sido enxaguados com solução de Ross; mas Ross não conseguiu atingir o armazenamento de 7 dias com esta técnica, mesmo quando a nefrectomia contralateral tardia foi usada.

Os requisitos para o armazenamento de perfusão hipotérmica de 72 horas foram posteriormente definidos por Collins, que mostrou que a perfusão pulsátil não era necessária se uma pressão de perfusão de 49 mm Hg fosse usada, e que 7 ° C era uma temperatura melhor para armazenamento do que 2 ° C ou 12 ° C. Ele também comparou várias composições de perfusato e descobriu que um perfusato tamponado com fosfato poderia ser usado com sucesso, eliminando assim a necessidade de um suprimento de dióxido de carbono. Grundmann também mostrou que uma pressão de perfusato baixa é adequada. Ele usou uma pressão pulsátil média de 20 mm Hg em perfusões de 72 horas e descobriu que isso deu melhores resultados do que as pressões médias de 15, 40, 50 ou 60 mm Hg.

O armazenamento bem-sucedido por até 8 dias foi relatado por Cohen usando vários tipos de perfusato - com o melhor resultado sendo obtido quando se usa um perfusato tamponado com fosfato a 8 ° C. A incapacidade de repetir esses experimentos bem-sucedidos foi pensada para ser devido às mudanças que foram feitas na maneira que o PPF foi fabricado com teor de ácido octanóico mais alto sendo prejudicial. O ácido octanóico demonstrou ser capaz de estimular a atividade metabólica durante a perfusão hipotérmica e isso pode ser prejudicial.

Natureza da lesão de preservação renal

Lesão estrutural

As mudanças estruturais que ocorrem durante o armazenamento hipotérmico de 72 horas de rins previamente ilesos foram descritas por Mackay que mostrou como havia vacuolização progressiva do citoplasma das células que afetavam particularmente os túbulos proximais . Na microscopia eletrônica, as mitocôndrias ficaram inchadas com a separação precoce das membranas cristalinas internas e posteriormente com a perda de toda a estrutura interna. A integridade lisossomal foi bem preservada até tarde, e a destruição da célula não parecia ser causada por enzimas líticas porque não havia mais lesão imediatamente adjacente aos lisossomas do que no resto da célula.

Woods e Liu - ao descreverem o armazenamento renal de 5 e 7 dias com sucesso - descreveram as alterações microscópicas de luz vistas no final da perfusão e na pós-morte, mas encontraram poucas anormalidades grosseiras além de alguma infiltração com linfócitos e atrofia tubular ocasional.

As alterações durante perfusões curtas de rins humanos antes do reimplante foram descritas por Hill, que também realizou biópsias 1 hora após o reimplante. Na microscopia eletrônica, Hill encontrou dano endotelial que se correlacionou com a gravidade da deposição de fibrina após o reimplante. As alterações que Hill viu nos glomérulos à microscopia de luz foram ocasionais trombos de fibrina e infiltração com polimorfos. Hill suspeitou que essas alterações eram uma lesão induzida imunologicamente, mas descobriu que não havia correlação entre a gravidade da lesão histológica e a presença ou ausência de depósitos de imunoglobulinas.

Existem vários relatos da análise da urina produzida pelos rins durante o armazenamento da perfusão. Kastagir analisou a urina produzida durante a perfusão de 24 horas e descobriu que era um ultrafiltrado do perfusato, Scott encontrou um traço de proteína na urina durante o armazenamento de 24 horas e Pederson encontrou apenas um traço de proteína após 36 horas de armazenamento da perfusão. Pederson mencionou que havia encontrado proteinúria pesada durante experimentos anteriores. Woods observou cilindros de proteína nos túbulos de rins viáveis ​​após 5 dias de armazenamento, mas não analisou a urina produzida durante a perfusão. No estudo de Cohen, houve um aumento progressivo na concentração de proteína urinária durante a preservação de 8 dias até que o conteúdo de proteína da urina se igualasse ao do perfusato. Isso pode estar relacionado ao inchaço das membranas basais glomerulares e à fusão progressiva dos processos do pé das células epiteliais que também foram observados durante o mesmo período de armazenamento da perfusão.

Mecanismos de lesão

Os mecanismos que danificam os rins durante o armazenamento hipotérmico podem ser subdivididos da seguinte forma:

  1. Lesão nos processos metabólicos da célula causada por:
    1. Resfriado
    2. Anoxia quando o rim está quente antes e depois do período de armazenamento hipotérmico.
    3. Falha em fornecer os nutrientes corretos.
    4. Acúmulo de toxinas no perfusato.
    5. Danos tóxicos do fluido de armazenamento.
    6. Eliminação de substratos essenciais das células renais.
  2. Lesão no DNA nuclear.
  3. Lesão mecânica do sistema vascular do rim durante a perfusão hipotérmica.
  4. Lesão pós-reimplante.

Lesão metabólica

Resfriado

Em temperaturas normais, os mecanismos de bombeamento nas paredes celulares retêm o potássio intracelular em níveis elevados e expelem o sódio. Se essas bombas falharem, o sódio é absorvido pela célula e o potássio é perdido. A água segue o sódio passivamente e resulta no inchaço das células. A importância desse controle do inchaço celular foi demonstrada por McLoughlin, que encontrou uma correlação significativa entre o conteúdo de água cortical renal canina e a capacidade dos rins de sustentar a vida após 36 horas de armazenamento. O mecanismo de bombeamento é acionado pelo sistema enzimático conhecido como Na + K + - ATPase ativada e é inibido pelo frio. Levy descobriu que a atividade metabólica a 10 ° C, conforme indicado pelas medições de consumo de oxigênio, foi reduzida para cerca de 5% do normal e, como todos os sistemas enzimáticos são afetados de maneira semelhante pela hipotermia, a atividade da ATPase é acentuadamente reduzida a 10 ° C.

Existem, no entanto, diferenças de tecidos e espécies na sensibilidade ao frio desta ATPase, que podem ser responsáveis ​​pelas diferenças na capacidade dos tecidos de resistir à hipotermia. Martin demonstrou que em células corticais renais de cães alguma atividade ATPase ainda está presente a 10 ° C, mas não a 0 ° C. No fígado e nas células do coração, a atividade foi completamente inibida a 10 ° C e essa diferença na sensibilidade ao frio da ATPase se correlacionou com a maior dificuldade em controlar o inchaço celular durante o armazenamento hipotérmico das células do fígado e do coração. Uma ATPase distinta é encontrada nas paredes dos vasos, e foi demonstrado por Belzer ser completamente inibida a 10 ° C, quando nesta temperatura a ATPase das células corticais do rim ainda está ativa. Esses experimentos foram realizados no endotélio aórtico, mas se o endotélio vascular do rim tem as mesmas propriedades, então a lesão vascular pode ser o fator limitante no armazenamento prolongado do rim.

Willis mostrou como os hibernadores obtêm parte de sua capacidade de sobreviver a baixas temperaturas por terem uma Na + K + -ATPase que é capaz de transportar sódio e potássio ativamente através de suas membranas celulares, a 5 ° C, cerca de seis vezes mais rápido do que os não hibernadores ; esta taxa de transporte é suficiente para prevenir o inchaço das células.

A taxa de resfriamento de um tecido também pode ser significativa na produção de danos aos sistemas enzimáticos. Francavilla mostrou que quando as fatias de fígado foram resfriadas rapidamente (resfriamento imediato a 12 ° C em 6 minutos), a glicólise anaeróbica, medida no reaquecimento a 37 ° C, foi inibida em cerca de 67% da atividade demonstrada nas fatias que foram submetidas para resfriamento retardado. No entanto, as fatias de rim de cães foram menos afetadas pelo resfriamento rápido do que as fatias de fígado.

Anoxia

Todas as células requerem ATP como fonte de energia para sua atividade metabólica. O rim é danificado pela anóxia quando as células corticais renais são incapazes de gerar ATP suficiente em condições anaeróbicas para atender às necessidades das células. Ao excisar um rim, alguma anóxia é inevitável no intervalo entre a divisão da artéria renal e o resfriamento do rim. Foi demonstrado por Bergstrom que 50% do conteúdo de ATP das células corticais do rim de um cão é perdido em 1 minuto após o clampeamento da artéria renal, e resultados semelhantes foram encontrados por Warnick em rins de camundongos inteiros, com uma queda no ATP celular de 50% após cerca de 30 segundos de anóxia quente. Warnick e Bergstrom também mostraram que o resfriamento do rim imediatamente após a remoção reduziu significativamente qualquer perda adicional de ATP. Quando esses rins não afetados pelo calor foram perfundidos com plasma hipotérmico oxigenado, os níveis de ATP foram reduzidos em 50% após o armazenamento de 24 horas e, após 48 horas, os níveis médios de ATP nos tecidos foram um pouco mais elevados, indicando que a síntese de ATP havia ocorrido. Pegg demonstrou que rins de coelho podem ressintetizar ATP após um período de armazenamento de perfusão após lesão por calor, mas nenhuma ressíntese ocorreu em rins não afetados por calor.

A anóxia quente também pode ocorrer durante o reimplante do rim após o armazenamento. Lannon mostrou, por meio de medições do metabolismo do succinato, como o rim era mais sensível a um período de hipóxia quente ocorrendo após o armazenamento do que ao mesmo período de hipóxia quente ocorrendo imediatamente antes do armazenamento.

Falta de nutrientes essenciais

O metabolismo ativo da glicose com produção de bicarbonato foi demonstrado por Pettersson e Cohen.

Os estudos de Pettersson avaliaram o metabolismo da glicose e dos ácidos graxos pelos rins durante o armazenamento de perfusão hipotérmica de 6 dias e ele descobriu que os rins consumiam glicose a 4,4 μmol / g / dia e ácidos graxos a 5,8 μmol / g / dia. No estudo de Cohen, os melhores rins armazenados em 8 dias consumiram glicose a uma taxa de 2,3 μmol / g / dia e 4,9 μmol / g / dia, respectivamente, o que tornou provável que eles estivessem usando ácidos graxos em taxas semelhantes aos rins de cães de Pettersson. A constância tanto da taxa de consumo de glicose quanto da taxa de produção de bicarbonato implicava que nenhum dano estava afetando a enzima glicolítica ou os sistemas enzimáticos da anidrase carbônica.

Lee mostrou que os ácidos graxos eram o substrato preferido do córtex renal do coelho em temperaturas normotérmicas, e a glicose o substrato preferido para as células medulares que normalmente se metabolizam anaerobicamente. Abodeely mostrou que tanto os ácidos graxos quanto a glicose podiam ser utilizados pela medula externa do rim do coelho, mas que a glicose era usada preferencialmente. Na hipotermia, as necessidades metabólicas do rim são muito reduzidas, mas ocorre um consumo mensurável de glicose, ácidos graxos e corpos cetônicos. Horsburgh mostrou que os lipídios são utilizados por rins hipotérmicos, com consumo de palmitato de 0-15% do normal no córtex renal de ratos a 15 ° C. Pettersson mostrou que, em uma base molar, a glicose e os ácidos graxos eram metabolizados por rins hipotermicamente perfundidos nas mesmas taxas. Huang demonstrou que o córtex do rim hipotérmico do cão perde lípido (perda de 35% do lípido total após 24 horas), a menos que oleato seja adicionado ao perfusato renal. Huang comentou que essa perda poderia afetar a estrutura da célula e que a perda também sugeria que o rim estava utilizando ácido graxo. Em uma publicação posterior, Huang mostrou que as fatias do córtex renal dos cães metabolizavam ácidos graxos, mas não glicose, a 10 ° C.

Mesmo se os nutrientes corretos forem fornecidos, eles podem ser perdidos por absorção na tubulação do sistema de preservação. Lee demonstrou que a borracha de silicone (um material amplamente utilizado em sistemas de preservação renal) absorveu 46% do ácido oleico do perfusato após 4 horas de perfusão.

Acúmulo de toxinas

Abouna mostrou que a amônia foi liberada no perfusato durante o armazenamento renal de 3 dias e sugeriu que isso pode ser tóxico para as células renais, a menos que removido por substituição frequente do perfusato. Algum suporte para o uso de troca de perfusato durante perfusões longas foi fornecido por Liu, que usou a troca de perfusato em seus experimentos de armazenamento de 7 dias bem-sucedidos. Grundmann também descobriu que a qualidade da preservação de 96 horas foi melhorada pelo uso de um volume duplo de perfusato ou pela troca do perfusato. No entanto, as conclusões de Grundmann foram baseadas em comparações com um grupo de controle de apenas 3 cães. Cohen não foi capaz de demonstrar qualquer produção de amônia durante 8 dias de perfusão e nenhum benefício da troca de perfusato; a alcalinidade progressiva que ocorreu durante a perfusão mostrou ser devido à produção de bicarbonato.

Danos tóxicos do perfusato

Certos perfusatos demonstraram ter efeitos tóxicos nos rins como resultado da inclusão inadvertida de determinados produtos químicos em sua formulação. Collins mostrou que a procaína incluída na formulação de seus fluidos de lavagem pode ser tóxica, e Pegg comentou como materiais tóxicos, como plastificantes de PVC, podem ser removidos da tubulação do circuito de perfusão. Dvorak mostrou que a adição de metil-prednisolona ao perfusato, considerada essencial por Woods, pode, em algumas circunstâncias, ser prejudicial. Ele mostrou que com mais de g de metil-prednisolona em 650 ml de perfusato (em comparação com 250 mg em 1 litro usado por Woods) alterações hemodinâmicas e estruturais irreversíveis foram produzidas no rim após 20 horas de perfusão. Havia necrose de alças capilares, oclusão dos espaços de Bowman, espessamento da membrana basal e lesão de células endoteliais.

Eliminação de substratos essenciais

O nível de nucleotídeos remanescentes na célula após o armazenamento foi considerado por Warnick como importante para determinar se a célula seria capaz de re-sintetizar ATP e se recuperar após o reaquecimento. A troca frequente do perfusato ou o uso de um grande volume de perfusato tem a desvantagem teórica de que os nucleotídeos de adenina quebrados podem ser lavados para fora das células e, portanto, não estar disponíveis para re-síntese em ATP quando o rim é reaquecido.

Lesão no DNA nuclear

O DNA nuclear é danificado durante o armazenamento refrigerado dos rins. Lazarus mostrou que quebras de DNA de fita simples ocorreram dentro de 16 horas em rins de camundongos armazenados hipotermicamente, com a lesão sendo um pouco inibida pelo armazenamento em soluções de Collins ou Sacks. Esta lesão nuclear diferiu daquela observada em lesão quente quando ocorreram rupturas de DNA de fita dupla.

Lesão mecânica do sistema vascular

Os métodos de armazenamento da perfusão podem lesionar mecanicamente o endotélio vascular do rim, o que leva à trombose arterial ou deposição de fibrina após o reimplante. Hill observou que, em rins humanos, a deposição de fibrina no glomérulo após o reimplante e a função pós-operatória, correlacionou-se com o tempo de armazenamento da perfusão. Ele havia feito biópsias na revascularização de rins humanos preservados por perfusão ou armazenamento de gelo, e mostrou por microscopia eletrônica que a ruptura endotelial ocorria apenas nos rins que haviam sido perfundidos. As biópsias realizadas uma hora após a revascularização mostraram plaquetas e fibrina aderidas a quaisquer áreas de membrana basal vascular desnudada. Um tipo diferente de dano vascular foi descrito por Sheil, que mostrou como uma lesão em jato pode ser produzida distal à cânula amarrada na artéria renal, levando à trombose arterial aproximadamente 1 cm distal ao local da cânula.

Lesão pós-reimplante

Há evidências de que mecanismos imunológicos podem lesar rins hipotermicamente perfundidos após o reimplante se o perfusato contiver anticorpos específicos. Cross descreveu dois pares de rins de cadáveres humanos que foram perfundidos simultaneamente com plasma crioprecipitado contendo anticorpo HLA específico para um dos pares. Ambos os rins sofreram trombose arterial precoce. Light descreveu rejeição hiperaguda semelhante após armazenamento de perfusão e mostrou que o plasma crioprecipitado usado continha anticorpo IgM citotóxico. Este perigo potencial de usar plasma crioprecipitado foi demonstrado experimentalmente por Filo que perfundiu rins de cão por 24 horas com plasma de cão crioprecipitado especificamente sensibilizado e descobriu que ele poderia induzir lesões glomerulares e vasculares com ingurgitamento capilar, edema endotelial, infiltração por leucócitos polimorfonucleares e trombose arterial. A microscopia imunofluorescente demonstrou ligação específica de IgG ao longo das superfícies endoteliais, nos glomérulos e também nos vasos. Após o reimplante, a fixação do complemento e o dano tecidual ocorreram em um padrão semelhante. Houve alguma correlação entre a gravidade do dano histológico e a função subsequente dos rins.

Muitos trabalhadores tentaram evitar o reaquecimento dos rins durante o reimplante, mas apenas Cohen descreveu o uso de um sistema de resfriamento ativo. As medições da liberação de enzima lisossomal de rins submetidos a anastomoses simuladas, quando dentro ou fora do sistema de resfriamento, demonstraram como os rins eram sensíveis ao reaquecimento após um período de armazenamento refrigerado e confirmaram a eficácia do sistema de resfriamento na prevenção da liberação de enzima. Um outro fator para minimizar lesões nas operações de reimplante pode ter sido que os rins foram mantidos a 7 ° C dentro da serpentina de resfriamento, que estava dentro de um grau da temperatura usada durante o armazenamento de perfusão, de modo que os rins não foram submetidos à maior mudanças na temperatura que teriam ocorrido se o resfriamento com gelo tivesse sido usado.

Dempster descreveu o uso de liberação lenta das pinças vasculares no final das operações de reimplante renal para evitar ferir o rim, mas outros trabalhadores não mencionaram se usaram ou não essa manobra. Depois que Cohen encontrou lesão vascular com sangramento intra-renal após 3 dias de armazenamento da perfusão, uma técnica de revascularização lenta foi usada para todos os experimentos subsequentes, com o objetivo de dar aos vasos intra-renais tempo para recuperar seu tônus ​​o suficiente para evitar que a pressão sistólica total fosse aplicado aos vasos glomerulares frágeis. A ausência de lesão vascular grave em suas perfusões posteriores pode ser atribuída ao uso desta manobra.

Referências