Microscopia - Microscopy

Exame microscópico em um laboratório bioquímico

Microscopia é o campo técnico do uso de microscópios para visualizar objetos e áreas de objetos que não podem ser vistos a olho nu (objetos que não estão dentro da faixa de resolução do olho normal). Existem três ramos bem conhecidos da microscopia: microscopia óptica , eletrônica e microscopia de varredura , junto com o campo emergente da microscopia de raios-X .

A microscopia óptica e a microscopia eletrônica envolvem a difração , reflexão ou refração da radiação eletromagnética / feixes de elétrons interagindo com o espécime e a coleta da radiação espalhada ou outro sinal para criar uma imagem. Este processo pode ser realizado por irradiação de campo amplo da amostra (por exemplo, microscopia de luz padrão e microscopia eletrônica de transmissão ) ou por varredura de um feixe fino sobre a amostra (por exemplo, microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de varredura ). A microscopia de varredura de sonda envolve a interação de uma sonda de varredura com a superfície do objeto de interesse. O desenvolvimento da microscopia revolucionou a biologia , deu origem ao campo da histologia e por isso continua a ser uma técnica essencial nas ciências físicas e da vida . A microscopia de raios-X é tridimensional e não destrutiva, permitindo imagens repetidas da mesma amostra para estudos in situ ou 4D e fornecendo a capacidade de "ver o interior" da amostra sendo estudada antes de sacrificá-la para técnicas de resolução mais alta. Um microscópio de raios X 3D usa a técnica de tomografia computadorizada (microCT), girando a amostra 360 graus e reconstruindo as imagens. A TC é normalmente realizada com um display de tela plana. Um microscópio de raios-X 3D emprega uma variedade de objetivas, por exemplo, de 4X a 40X, e também pode incluir um painel plano.

História

Muitas vezes considerado o primeiro microscopista e microbiologista reconhecido , Antonie van Leeuwenhoek é mais conhecido por seu trabalho pioneiro no campo da microscopia e por suas contribuições para o estabelecimento da microbiologia como uma disciplina científica.

O campo da microscopia (microscopia óptica ) remonta pelo menos ao século XVII. Microscópios anteriores, lupas de lente única com ampliação limitada, datam pelo menos desde o amplo uso de lentes em óculos no século 13, mas microscópios compostos mais avançados apareceram pela primeira vez na Europa por volta de 1620. Os primeiros praticantes da microscopia incluem Galileo Galilei , que descobriu em 1610 que poderia focar seu telescópio para ver pequenos objetos de perto e Cornelis Drebbel , que pode ter inventado o microscópio composto por volta de 1620 Antonie van Leeuwenhoek desenvolveu um microscópio simples de ampliação muito alta na década de 1670 e é frequentemente considerado o primeiro microscopista e microbiologista reconhecido .

Microscopia ótica

Microscópio estéreo

A microscopia ótica ou de luz envolve a passagem da luz visível transmitida ou refletida da amostra através de uma única lente ou lentes múltiplas para permitir uma visão ampliada da amostra. A imagem resultante pode ser detectada diretamente a olho nu, visualizada em uma placa fotográfica ou capturada digitalmente . A única lente com seus acessórios, ou o sistema de lentes e equipamento de imagem, junto com o equipamento de iluminação apropriado, estágio de amostra e suporte, constitui o microscópio de luz básico. O desenvolvimento mais recente é o microscópio digital , que usa uma câmera CCD para focar na exposição de interesse. A imagem é mostrada na tela do computador, portanto, as oculares são desnecessárias.

Limitações

As limitações da microscopia óptica padrão ( microscopia de campo claro ) estão em três áreas;

  • Essa técnica só consegue criar imagens de objetos escuros ou com forte refração de maneira eficaz.
  • Existe uma resolução limitada por difração dependendo do comprimento de onda incidente; na faixa visível, a resolução da microscopia óptica é limitada a aproximadamente 0,2   micrômetros ( ver: microscópio ) e o limite de ampliação prático a ~ 1500x.
  • A luz fora de foco de pontos fora do plano focal reduz a clareza da imagem.


As células vivas em particular geralmente carecem de contraste suficiente para serem estudadas com sucesso, uma vez que as estruturas internas da célula são incolores e transparentes. A maneira mais comum de aumentar o contraste é manchar as diferentes estruturas com corantes seletivos, mas isso geralmente envolve matar e fixar a amostra. A coloração também pode introduzir artefatos , que são detalhes estruturais aparentes causados ​​pelo processamento da amostra e, portanto, não são características legítimas da amostra. Em geral, essas técnicas fazem uso de diferenças no índice de refração das estruturas celulares. A microscopia de campo claro é comparável a olhar através de uma janela de vidro: não se vê o vidro, mas apenas a sujeira nele. Há uma diferença, pois o vidro é um material mais denso, e isso cria uma diferença na fase da luz que passa. O olho humano não é sensível a essa diferença de fase, mas soluções ópticas inteligentes foram criadas para transformar essa diferença de fase em uma diferença de amplitude (intensidade de luz).

Técnicas

Para melhorar o contraste da amostra ou destacar certas estruturas em uma amostra, técnicas especiais devem ser usadas. Uma grande seleção de técnicas de microscopia está disponível para aumentar o contraste ou marcar uma amostra.

Campo brilhante

A microscopia de campo claro é a mais simples de todas as técnicas de microscopia de luz. A iluminação da amostra é por meio de luz branca transmitida, ou seja, iluminada de baixo e observada de cima. As limitações incluem baixo contraste da maioria das amostras biológicas e baixa resolução aparente devido ao borrão do material fora de foco. A simplicidade da técnica e a preparação mínima da amostra necessária são vantagens significativas.

Iluminação oblíqua

O uso de iluminação oblíqua (lateral) dá à imagem uma aparência tridimensional (3D) e pode destacar recursos que de outra forma seriam invisíveis. Uma técnica mais recente baseada neste método é o contraste de modulação de Hoffmann , um sistema encontrado em microscópios invertidos para uso em cultura de células. A iluminação oblíqua sofre das mesmas limitações da microscopia de campo brilhante (baixo contraste de muitas amostras biológicas; baixa resolução aparente devido a objetos fora de foco).

Campo escuro

A microscopia de campo escuro é uma técnica para melhorar o contraste de amostras transparentes e não coradas. A iluminação de campo escuro usa uma fonte de luz cuidadosamente alinhada para minimizar a quantidade de luz transmitida diretamente (não espalhada) que entra no plano da imagem, coletando apenas a luz espalhada pela amostra. O campo escuro pode melhorar drasticamente o contraste da imagem - especialmente de objetos transparentes - enquanto requer pouca configuração de equipamento ou preparação de amostra. No entanto, a técnica sofre de baixa intensidade de luz na imagem final de muitas amostras biológicas e continua a ser afetada pela baixa resolução aparente.

Uma diatomácea sob iluminação Rheinberg

A iluminação Rheinberg é uma variante especial da iluminação de campo escuro na qual filtros coloridos transparentes são inseridos logo antes do condensador, de modo que os raios de luz na abertura alta sejam coloridos de forma diferente daqueles com abertura baixa (ou seja, o fundo do espécime pode ser azul, enquanto o objeto parece vermelho auto-luminoso). Outras combinações de cores são possíveis, mas sua eficácia é bastante variável.

Coloração de dispersão

A coloração por dispersão é uma técnica óptica que resulta em uma imagem colorida de um objeto incolor. Esta é uma técnica de coloração óptica e não requer manchas ou corantes para produzir um efeito de cor. Existem cinco configurações diferentes de microscópio usadas na técnica mais ampla de coloração por dispersão. Eles incluem linha de Becke de campo claro, oblíqua, campo escuro, contraste de fase e coloração de dispersão de parada objetiva.

Contraste de fase

Em microscopia eletrônica : imagem de contraste de fase

Técnicas mais sofisticadas mostrarão diferenças proporcionais na densidade óptica. O contraste de fase é uma técnica amplamente usada que mostra as diferenças no índice de refração como diferença no contraste. Foi desenvolvido pelo físico holandês Frits Zernike na década de 1930 (pelo qual recebeu o Prêmio Nobel em 1953). O núcleo de uma célula, por exemplo, aparecerá escuro contra o citoplasma circundante. O contraste é excelente; no entanto, não deve ser usado com objetos grossos. Freqüentemente, um halo é formado mesmo em torno de pequenos objetos, o que obscurece os detalhes. O sistema consiste em um anel circular no condensador, que produz um cone de luz. Este cone é sobreposto a um anel de tamanho semelhante dentro da objetiva de fase. Cada objetiva tem um anel de tamanho diferente, portanto, para cada objetiva, outra configuração de condensador deve ser escolhida. O anel na objetiva tem propriedades ópticas especiais: ele, em primeiro lugar, reduz a intensidade da luz direta, mas o mais importante, ele cria uma diferença de fase artificial de cerca de um quarto do comprimento de onda. Como as propriedades físicas dessa luz direta foram alteradas, ocorre interferência com a luz difratada, resultando na imagem de contraste de fase. Uma desvantagem da microscopia de contraste de fase é a formação de halo (anel de luz de halo).

Contraste de interferência diferencial

Superior e muito mais caro é o uso de contraste de interferência . As diferenças na densidade óptica aparecerão como diferenças no relevo. Um núcleo dentro de uma célula realmente aparecerá como um glóbulo no sistema de contraste de interferência diferencial mais usado , de acordo com Georges Nomarski . No entanto, deve-se ter em mente que se trata de um efeito ótico , e o relevo não se assemelha necessariamente à forma real. O contraste é muito bom e a abertura do condensador pode ser usada totalmente aberta, reduzindo assim a profundidade de campo e maximizando a resolução.

O sistema consiste em um prisma especial (prisma Nomarski , prisma Wollaston ) no condensador que divide a luz em um feixe comum e um feixe extraordinário. A diferença espacial entre os dois feixes é mínima (menor que a resolução máxima da objetiva). Após a passagem pelo corpo de prova, os feixes são reunidos por um prisma semelhante na objetiva.

Em uma amostra homogênea, não há diferença entre os dois feixes e nenhum contraste está sendo gerado. No entanto, próximo a um limite refrativo (digamos, um núcleo dentro do citoplasma), a diferença entre o feixe comum e o extraordinário irá gerar um relevo na imagem. O contraste de interferência diferencial requer uma fonte de luz polarizada para funcionar; dois filtros polarizadores devem ser colocados no caminho da luz, um abaixo do condensador (o polarizador) e o outro acima da objetiva (o analisador).

Nota: Nos casos em que o desenho óptico de um microscópio produz uma separação lateral apreciável dos dois feixes, temos o caso da microscopia de interferência clássica , que não resulta em imagens de relevo, mas pode, no entanto, ser usada para a determinação quantitativa de espessuras de massa de objetos microscópicos.

Reflexão de interferência

Uma técnica adicional que usa interferência é a microscopia de reflexão de interferência (também conhecida como contraste de interferência refletido ou RIC). Ele depende da adesão das células à lâmina para produzir um sinal de interferência. Se não houver nenhuma célula conectada ao vidro, não haverá interferência.

A microscopia de reflexão de interferência pode ser obtida usando os mesmos elementos usados ​​pelo DIC, mas sem os prismas. Além disso, a luz que está sendo detectada é refletida e não transmitida como quando o DIC é empregado.

Fluorescência

As imagens também podem conter artefatos . Esta é uma micrografia de fluorescência confocal de varredura a laser da antera do agrião (parte do estame ). A imagem mostra, entre outras coisas, uma bela estrutura vermelha em forma de colarinho logo abaixo da antera. No entanto, um estame de agrião intacto não tem tal colar, este é um artefato de fixação: o estame foi cortado abaixo da moldura da imagem, e a epiderme (camada superior de células) do talo do estame foi descascada, formando uma estrutura não característica . Foto: Heiti Paves da Tallinn University of Technology .

Quando certos compostos são iluminados com luz de alta energia, eles emitem luz de frequência mais baixa. Este efeito é conhecido como fluorescência . Freqüentemente, os espécimes mostram sua imagem de autofluorescência característica , com base em sua composição química.

Esse método é de fundamental importância nas ciências da vida modernas, pois pode ser extremamente sensível, permitindo a detecção de moléculas únicas. Muitos corantes fluorescentes diferentes podem ser usados ​​para manchar diferentes estruturas ou compostos químicos. Um método particularmente poderoso é a combinação de anticorpos acoplados a um fluoróforo como na imunocoloração . Exemplos de fluoróforos comumente usados ​​são a fluoresceína ou a rodamina .

Os anticorpos podem ser feitos sob medida para um composto químico. Por exemplo, uma estratégia frequentemente usada é a produção artificial de proteínas, com base no código genético (DNA). Essas proteínas podem então ser usadas para imunizar coelhos, formando anticorpos que se ligam à proteína. Os anticorpos são então acoplados quimicamente a um fluoróforo e usados ​​para rastrear as proteínas nas células em estudo.

Proteínas fluorescentes altamente eficientes , como a proteína fluorescente verde (GFP), foram desenvolvidas usando a técnica de biologia molecular de fusão gênica , um processo que liga a expressão do composto fluorescente à da proteína alvo. Essa proteína fluorescente combinada é, em geral, não tóxica para o organismo e raramente interfere na função da proteína em estudo. As células ou organismos geneticamente modificados expressam diretamente as proteínas marcadas com fluorescência, o que permite o estudo da função da proteína original in vivo .

O crescimento de cristais de proteína resulta em cristais de proteína e sal. Ambos são incolores e microscópicos. A recuperação dos cristais de proteína requer imagens que podem ser feitas pela fluorescência intrínseca da proteína ou usando microscopia de transmissão. Ambos os métodos requerem um microscópio ultravioleta, pois a proteína absorve luz a 280 nm. A proteína também irá fluorescência em aproximadamente 353 nm quando excitada com luz de 280 nm.

Uma vez que a emissão de fluorescência difere em comprimento de onda (cor) da luz de excitação, uma imagem fluorescente ideal mostra apenas a estrutura de interesse que foi marcada com o corante fluorescente. Essa alta especificidade levou ao uso generalizado da microscopia de luz de fluorescência na pesquisa biomédica. Diferentes corantes fluorescentes podem ser usados ​​para tingir diferentes estruturas biológicas, que podem então ser detectadas simultaneamente, embora ainda sejam específicas devido à cor individual do corante.

Para impedir que a luz de excitação alcance o observador ou o detector, são necessários conjuntos de filtros de alta qualidade. Estes normalmente consistem em um filtro de excitação selecionando a faixa de comprimentos de onda de excitação , um espelho dicróico e um filtro de emissão bloqueando a luz de excitação. A maioria dos microscópios de fluorescência são operados no modo Epi-iluminação (iluminação e detecção de um lado da amostra) para diminuir ainda mais a quantidade de luz de excitação que entra no detector.

Veja também: microscópio de fluorescência de reflexão interna total Neurociência

Confocal

A microscopia confocal de varredura a laser usa um feixe de laser focalizado (por exemplo, 488 nm) que é varrido pela amostra para excitar a fluorescência ponto a ponto. A luz emitida é direcionada através de um orifício para evitar que a luz fora de foco alcance o detector, normalmente um tubo fotomultiplicador . A imagem é construída em um computador, plotando as intensidades de fluorescência medidas de acordo com a posição do laser de excitação. Em comparação com a iluminação da amostra completa, a microscopia confocal oferece uma resolução lateral ligeiramente maior e melhora significativamente o corte óptico (resolução axial). A microscopia confocal é, portanto, comumente usada onde a estrutura 3D é importante.

Uma subclasse de microscópios confocais são microscópios de disco giratório que são capazes de varrer vários pontos simultaneamente na amostra. Um disco correspondente com orifícios rejeita a luz fora de foco. O detector de luz em um microscópio de disco giratório é uma câmera digital, normalmente EM-CCD ou sCMOS .

Microscopia de dois fótons

Um microscópio de dois fótons também é um microscópio de varredura a laser, mas em vez de luz laser UV, azul ou verde, um laser infravermelho pulsado é usado para excitação. Apenas no minúsculo foco do laser a intensidade é alta o suficiente para gerar fluorescência por excitação de dois fótons , o que significa que nenhuma fluorescência fora de foco é gerada e nenhum orifício é necessário para limpar a imagem. Isso permite imagens profundas no tecido de dispersão, onde um microscópio confocal não seria capaz de coletar fótons de forma eficiente. Microscópios de dois fótons com detecção de campo amplo são freqüentemente usados ​​para imagens funcionais, por exemplo , imagens de cálcio , no tecido cerebral. Eles são comercializados como microscópios multifotônicos por várias empresas, embora os ganhos do uso de 3 fótons em vez da excitação de 2 fótons sejam marginais.

Microscopia de iluminação de plano único e microscopia de fluorescência de folha de luz

Usando um plano de luz formado pela focalização da luz através de uma lente cilíndrica em um ângulo estreito ou pela varredura de uma linha de luz em um plano perpendicular ao eixo da objetiva, seções ópticas de alta resolução podem ser obtidas. A iluminação de plano único, ou iluminação de folha de luz, também é obtida usando técnicas de modelagem de feixe que incorporam expansores de feixe de prisma múltiplo . As imagens são capturadas por CCDs. Essas variantes permitem uma captura de imagem de relação sinal / ruído muito rápida e alta.

Microscopia multifotônica de campo amplo

A microscopia multifotônica de campo amplo se refere a uma técnica de imagem óptica não linear na qual uma grande área do objeto é iluminada e gerada sem a necessidade de varredura. Altas intensidades são necessárias para induzir processos ópticos não lineares, como fluorescência de dois fótons ou geração de segundo harmônico . Em microscópios multifotônicos de varredura, as altas intensidades são obtidas focalizando firmemente a luz, e a imagem é obtida por varredura de feixe. Na microscopia multifotônica de campo amplo, as altas intensidades são melhor alcançadas usando uma fonte de laser pulsado opticamente amplificado para obter um grande campo de visão (~ 100 µm). A imagem neste caso é obtida como um único quadro com uma câmera CCD sem a necessidade de digitalização, tornando a técnica particularmente útil para visualizar processos dinâmicos simultaneamente através do objeto de interesse. Com a microscopia multifotônica de campo amplo, a taxa de quadros pode ser aumentada em até 1000 vezes em comparação com a microscopia multifotônica de varredura . No tecido de dispersão, no entanto, a qualidade da imagem se degrada rapidamente com o aumento da profundidade.

Deconvolução

A microscopia de fluorescência é uma técnica poderosa para mostrar estruturas especificamente marcadas em um ambiente complexo e para fornecer informações tridimensionais de estruturas biológicas. No entanto, essa informação é borrada pelo fato de que, após a iluminação, todas as estruturas marcadas com fluorescência emitem luz, independentemente de estarem em foco ou não. Portanto, a imagem de uma determinada estrutura é sempre borrada pela contribuição da luz de estruturas que estão fora de foco. Esse fenômeno resulta em uma perda de contraste, especialmente ao usar objetivas com alto poder de resolução, normalmente objetivas de imersão em óleo com alta abertura numérica.

Função Point Spread modelada matematicamente de um sistema de imagem a laser THz pulsado.

No entanto, o desfoque não é causado por processos aleatórios, como dispersão de luz, mas pode ser bem definido pelas propriedades ópticas da formação da imagem no sistema de imagem do microscópio. Se considerarmos uma pequena fonte de luz fluorescente (essencialmente um ponto brilhante), a luz proveniente deste ponto se espalha mais longe de nossa perspectiva conforme o ponto fica mais fora de foco. Em condições ideais, isso produz uma forma de "ampulheta" desta fonte pontual na terceira dimensão (axial). Essa forma é chamada de função de difusão de ponto (PSF) do sistema de imagem do microscópio. Uma vez que qualquer imagem de fluorescência é composta por um grande número de pequenas fontes de luz fluorescente, a imagem é considerada "convolvida pela função de propagação de pontos". O PSF modelado matematicamente de um sistema de imagem pulsada a laser terahertz é mostrado à direita.

A saída de um sistema de imagem pode ser descrita usando a equação:

Onde n é o ruído aditivo. Conhecer essa função de propagação de pontos significa que é possível reverter esse processo até certo ponto por métodos baseados em computador comumente conhecidos como microscopia de deconvolução . Existem vários algoritmos disponíveis para deconvolução 2D ou 3D. Eles podem ser grosseiramente classificados em não reparador e restaurador métodos. Embora os métodos não restaurativos possam melhorar o contraste removendo a luz fora de foco dos planos focais, apenas os métodos restauradores podem realmente reatribuir a luz ao seu local de origem adequado. O processamento de imagens fluorescentes dessa maneira pode ser uma vantagem sobre a aquisição direta de imagens sem luz fora de foco, como imagens de microscopia confocal , porque os sinais de luz de outra forma eliminados tornam-se informações úteis. Para a deconvolução 3D, normalmente fornece-se uma série de imagens tiradas de diferentes planos focais (chamados de Z-stack) mais o conhecimento do PSF, que pode ser derivado experimentalmente ou teoricamente do conhecimento de todos os parâmetros contribuintes do microscópio.

Técnicas de sub-difração

Exemplo de microscopia de super-resolução. Imagem de Her3 e Her2 , alvo do medicamento contra câncer de mama Trastuzumab , dentro de uma célula cancerosa.

Uma infinidade de técnicas de microscopia de super-resolução foram desenvolvidas nos últimos tempos, as quais contornam o limite de difração .

Isso é obtido principalmente por meio da geração de imagens de uma amostra suficientemente estática várias vezes e pela modificação da luz de excitação ou pela observação de mudanças estocásticas na imagem. Os métodos de deconvolução descritos na seção anterior, que remove o borrão induzido por PSF e atribui uma origem matematicamente "correta" da luz, são usados, embora com uma compreensão ligeiramente diferente do que o valor de um pixel significa. Supondo que, na maioria das vezes , um único fluoróforo contribui para um único blob em uma única imagem obtida, os blobs nas imagens podem ser substituídos por sua posição calculada, melhorando muito a resolução para bem abaixo do limite de difração.

Para realizar tal suposição, o conhecimento e o controle químico sobre a fotofísica do fluoróforo estão no centro dessas técnicas, por meio das quais resoluções de ~ 20 nanômetros são obtidas regularmente.

Microscopia amplificada codificada em série com tempo

A microscopia amplificada codificada em tempo serial (STEAM) é um método de imagem que fornece velocidade de obturador ultrarrápida e taxa de quadros, usando amplificação de imagem óptica para contornar a troca fundamental entre sensibilidade e velocidade, e um fotodetector de pixel único para eliminar a necessidade de um matriz de detector e limitações de tempo de leitura O método é pelo menos 1000 vezes mais rápido do que as câmeras CCD e CMOS de última geração . Consequentemente, é potencialmente útil para uma ampla gama de aplicações científicas, industriais e biomédicas que requerem altas taxas de aquisição de imagem, incluindo diagnóstico em tempo real e avaliação de ondas de choque, microfluídica , MEMS e cirurgia a laser .

Extensões

A maioria dos instrumentos modernos oferece soluções simples para microfotografia e registro eletrônico de imagens. No entanto, esses recursos nem sempre estão presentes e o microscopista mais experiente, em muitos casos, ainda preferirá uma imagem desenhada à mão a uma fotografia. Isso ocorre porque um microscopista com conhecimento do assunto pode converter com precisão uma imagem tridimensional em um desenho bidimensional preciso. Em uma fotografia ou outro sistema de captura de imagem, entretanto, apenas um plano fino está sempre em bom foco.

A criação de micrografias cuidadosas e precisas requer uma técnica microscópica usando uma ocular monocular. É essencial que ambos os olhos estejam abertos e que o olho que não está observando no microscópio se concentre em uma folha de papel na bancada ao lado do microscópio. Com a prática, e sem mover a cabeça ou os olhos, é possível registrar com precisão os detalhes observados traçando ao redor das formas observadas, "vendo" simultaneamente a ponta do lápis na imagem microscópica.

Praticar esta técnica também estabelece uma boa técnica microscópica geral. É sempre menos cansativo observar com o microscópio focado para que a imagem seja vista no infinito e com os dois olhos abertos o tempo todo.

Outras melhorias

Microspectroscopia: espectroscopia com microscópio

Raio X

Como a resolução depende do comprimento de onda da luz. A microscopia eletrônica foi desenvolvida desde 1930, que usa feixes de elétrons em vez de luz. Por causa do comprimento de onda muito menor do feixe de elétrons, a resolução é muito maior.

Embora menos comum, a microscopia de raios X também foi desenvolvida desde o final dos anos 1940. A resolução da microscopia de raios X situa-se entre a microscopia de luz e a microscopia eletrônica.

Microscópio eletrônico

Até a invenção da microscopia de sub-difração, o comprimento de onda da luz limitava a resolução da microscopia tradicional a cerca de 0,2 micrômetros. Para obter maior resolução, o uso de um feixe de elétrons com um comprimento de onda muito menor é usado em microscópios eletrônicos.

  • A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é bastante semelhante ao microscópio óptico composto, enviando um feixe de elétrons através de uma fatia muito fina da amostra. O limite de resolução em 2005 era de cerca de 0,05 nanômetro e não aumentou significativamente desde então.
  • A microscopia eletrônica de varredura (SEM) visualiza detalhes nas superfícies das amostras e oferece uma visão 3D muito agradável. Ele fornece resultados muito semelhantes aos do microscópio estereofônico. A melhor resolução para SEM em 2011 foi de 0,4 nanômetro.

Microscópios eletrônicos equipados para espectroscopia de raios-X podem fornecer análises elementares qualitativas e quantitativas. Este tipo de microscópio eletrônico, também conhecido como microscópio eletrônico analítico, pode ser uma ferramenta de caracterização muito poderosa para investigação de nanomateriais.

Microscopia de varredura de sonda

Esta é uma técnica de sub-difração. Exemplos de microscópios de sonda de varredura são o microscópio de força atômica (AFM), o microscópio de tunelamento de varredura , o microscópio de força fotônica e o microscópio de rastreamento de recorrência . Todos esses métodos usam o contato físico de uma ponta de sonda sólida para escanear a superfície de um objeto, que se supõe ser quase plana.

Força ultrassônica

A microscopia de força ultrassônica (UFM) foi desenvolvida para melhorar os detalhes e o contraste da imagem em áreas "planas" de interesse, onde as imagens de AFM têm contraste limitado. A combinação de AFM-UFM permite que uma imagem microscópica acústica de campo próximo seja gerada. A ponta AFM é usada para detectar as ondas ultrassônicas e supera a limitação de comprimento de onda que ocorre na microscopia acústica. Usando as mudanças elásticas sob a ponta do AFM, uma imagem com muito mais detalhes do que a topografia do AFM pode ser gerada.

A microscopia de força ultrassônica permite o mapeamento local da elasticidade na microscopia de força atômica pela aplicação de vibração ultrassônica ao cantilever ou amostra. Na tentativa de analisar os resultados da microscopia de força ultrassônica de forma quantitativa, uma medição da curva força-distância é feita com vibração ultrassônica aplicada à base do cantilever, e os resultados são comparados com um modelo da dinâmica do cantilever e interação ponta-amostra com base na técnica de diferenças finitas.

Microscopia ultravioleta

Os microscópios ultravioleta têm dois propósitos principais. O primeiro é utilizar o comprimento de onda mais curto da energia eletromagnética ultravioleta para melhorar a resolução da imagem além do limite de difração dos microscópios ópticos padrão. Essa técnica é usada para inspeção não destrutiva de dispositivos com recursos muito pequenos, como os encontrados em semicondutores modernos. A segunda aplicação para microscópios UV é o aumento de contraste, onde a resposta de amostras individuais é aumentada, em relação ao seu ambiente, devido à interação da luz com as moléculas dentro da própria amostra. Um exemplo é o crescimento de cristais de proteínas . Os cristais de proteína são formados em soluções salinas. Como os cristais de sal e proteína são formados no processo de crescimento, e ambos são comumente transparentes ao olho humano, eles não podem ser diferenciados com um microscópio óptico padrão. Como o triptofano da proteína absorve luz a 280 nm, a imagem com um microscópio UV com filtros passa-banda de 280 nm torna simples a diferenciação entre os dois tipos de cristais. Os cristais de proteína aparecem escuros enquanto os cristais de sal são transparentes.

Microscopia infravermelha

O termo microscopia infravermelha se refere à microscopia realizada em comprimentos de onda infravermelhos . Na configuração típica do instrumento, um Espectrômetro de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) é combinado com um microscópio óptico e um detector de infravermelho . O detector infravermelho pode ser um detector de ponto único, uma matriz linear ou uma matriz de plano focal 2D. O FTIR oferece a capacidade de realizar análises químicas por meio de espectroscopia de infravermelho e o microscópio e o detector de ponto ou array permitem que essa análise química seja espacialmente resolvida, ou seja, realizada em diferentes regiões da amostra. Como tal, a técnica também é chamada de microespectroscopia infravermelha. Uma arquitetura alternativa chamada Laser Direct Infrared (LDIR) envolve a combinação de uma fonte de luz infravermelha ajustável e um detector de ponto único em uma objetiva voadora). Esta técnica é freqüentemente usada para imagens químicas infravermelhas , onde o contraste da imagem é determinado pela resposta de regiões individuais da amostra a comprimentos de onda de IR específicos selecionados pelo usuário, geralmente bandas de absorção de IR específicas e ressonâncias moleculares associadas . Uma limitação chave da microspectroscopia infravermelha convencional é que a resolução espacial é limitada pela difração . Especificamente, a resolução espacial é limitada a uma figura relacionada ao comprimento de onda da luz. Para microscópios infravermelhos práticos, a resolução espacial é limitada a 1-3x o comprimento de onda, dependendo da técnica específica e do instrumento usado. Para comprimentos de onda de infravermelho médio, isso define um limite de resolução espacial prático de ~ 3-30 μm.

Também existem versões de infravermelho de microscopia de sub-difração. Estes incluem microscópio óptico de varredura de campo próximo IR (NSOM) , microspectroscopia fototérmica e espectroscopia infravermelha baseada em microscópio de força atômica (AFM-IR) , bem como microscopia óptica de varredura de campo próximo de tipo espalhamento (s-SNOM) e nano-FTIR que fornecer resolução espacial em nanoescala em comprimentos de onda de infravermelho.

Microscopia holográfica digital

Células humanas fotografadas por DHM phase shift (esquerda) e microscopia de contraste de fase (direita).

Na microscopia holográfica digital (DHM), as frentes de onda de interferência de uma fonte de luz coerente (monocromática) são registradas em um sensor. A imagem é reconstruída digitalmente por um computador a partir do holograma gravado . Além da imagem de campo claro comum, uma imagem de deslocamento de fase é criada.

O DHM pode operar em modo de reflexão e transmissão. No modo de reflexão, a imagem de deslocamento de fase fornece uma medição de distância relativa e, portanto, representa um mapa topográfico da superfície refletora. No modo de transmissão, a imagem de deslocamento de fase fornece uma medição quantitativa sem etiqueta da espessura óptica da amostra. As imagens de mudança de fase de células biológicas são muito semelhantes às imagens de células coradas e foram analisadas com sucesso por software de análise de alto conteúdo .

Um recurso exclusivo do DHM é a capacidade de ajustar o foco após a gravação da imagem, uma vez que todos os planos de foco são gravados simultaneamente pelo holograma. Este recurso possibilita a imagem de partículas em movimento em um volume ou a varredura rápida de uma superfície. Outro recurso atraente é a capacidade do DHM de usar ótica de baixo custo corrigindo aberrações óticas por software.

Patologia digital (microscopia virtual)

A patologia digital é um ambiente de informação baseado em imagens habilitado por tecnologia de computador que permite o gerenciamento de informações geradas a partir de um slide digital. A patologia digital é possibilitada em parte pela microscopia virtual , que é a prática de converter lâminas de vidro em lâminas digitais que podem ser visualizadas, gerenciadas e analisadas.

Microscopia a laser

A microscopia a laser é um campo de rápido crescimento que usa fontes de iluminação a laser em várias formas de microscopia. Por exemplo, a microscopia a laser focada em aplicações biológicas usa lasers de pulso ultracurto , em uma série de técnicas rotuladas como microscopia não linear, microscopia de saturação e microscopia de excitação de dois fótons .

Lasers de raios-X de laboratório de pulso curto e alta intensidade estão em desenvolvimento há vários anos. Quando essa tecnologia se concretizar, será possível obter imagens tridimensionais ampliadas de estruturas biológicas elementares no estado vivo em um instante precisamente definido. Para um contraste ideal entre água e proteína e para melhor sensibilidade e resolução, o laser deve ser ajustado próximo à linha de nitrogênio em cerca de 0,3 nanômetros. A resolução será limitada principalmente pela expansão hidrodinâmica que ocorre enquanto o número necessário de fótons está sendo registrado. Assim, enquanto o espécime é destruído pela exposição, sua configuração pode ser capturada antes de explodir.

Os cientistas têm trabalhado em projetos práticos e protótipos para microscópios holográficos de raios-X, apesar do desenvolvimento prolongado do laser apropriado.

Microscopia fotoacústica

Técnica de microscopia baseada no efeito fotoacústico , ou seja, a geração de (ultra) som causado pela absorção de luz. Um feixe de laser focalizado e com intensidade modulada é varrido por varredura em uma amostra. O (ultra) som gerado é detectado por meio de um transdutor de ultrassom. Comumente, transdutores de ultrassom piezoelétricos são empregados.

O contraste da imagem está relacionado ao coeficiente de absorção da amostra . Isso está em contraste com a microscopia de campo claro ou escuro, onde o contraste da imagem é devido à transmitância ou espalhamento. Em princípio, o contraste da microscopia de fluorescência também é proporcional à absorção da amostra. No entanto, na microscopia de fluorescência, o rendimento quântico de fluorescência precisa ser diferente de zero para que um sinal possa ser detectado. Na microscopia fotoacústica, no entanto, cada substância absorvente emite um sinal fotoacústico que é proporcional a

Aqui está o coeficiente de Grüneisen, é a energia do fóton do laser e é a energia do gap da amostra. Portanto, a microscopia fotoacústica parece bem adequada como uma técnica complementar à microscopia de fluorescência, pois um alto rendimento quântico de fluorescência leva a altos sinais de fluorescência e um baixo rendimento quântico de fluorescência leva a altos sinais fotoacústicos.

Negligenciando os efeitos não lineares, a resolução lateral dx é limitada pelo limite de difração de Abbe :

onde é o comprimento de onda do laser de excitação e NA é a abertura numérica da lente objetiva. O limite de difração de Abbe é mantido se a frente de onda de entrada for paralela. Na realidade, porém, o perfil do feixe de laser é gaussiano. Portanto, para calcular a resolução alcançável, fórmulas para feixes gaussianos truncados devem ser usadas.

Microscopia amadora

Microscopia Amadora é a investigação e observação de espécimes biológicos e não biológicos para fins recreativos. Coletores de minerais , insetos , conchas e plantas podem usar microscópios como ferramentas para descobrir recursos que os ajudam a classificar seus itens coletados. Outros amadores podem estar interessados ​​em observar a vida encontrada na água do lago e de outras amostras. Os microscópios também podem ser úteis para a avaliação da qualidade da água para pessoas que mantêm um aquário em casa . A documentação fotográfica e o desenho das imagens microscópicas são tarefas adicionais que aumentam o espectro de tarefas do amador. Existem até concursos de arte fotomicrográfica . Os participantes desse passatempo podem usar lâminas microscópicas comercialmente preparadas ou se envolver na tarefa de preparação de amostras.

Embora a microscopia seja uma ferramenta central na documentação de espécimes biológicos, ela é, em geral, insuficiente para justificar a descrição de uma nova espécie apenas com base em investigações microscópicas. Freqüentemente, testes genéticos e bioquímicos são necessários para confirmar a descoberta de uma nova espécie. É necessário laboratório e acesso à literatura acadêmica, especializada e, em geral, não acessível aos amadores. Há, no entanto, uma grande vantagem que os amadores têm sobre os profissionais: tempo para explorar seus arredores. Freqüentemente, amadores avançados se unem a profissionais para validar suas descobertas e (possivelmente) descrever novas espécies.

No final dos anos 1800, a microscopia amadora se tornou um hobby popular nos Estados Unidos e na Europa. Vários 'amadores profissionais' estavam sendo pagos por suas viagens de amostragem e explorações microscópicas por filantropos, para mantê-los entretidos na tarde de domingo (por exemplo, o especialista em diatomáceas A. Grunow, sendo pago por (entre outros) um industrial belga). O professor John Phin publicou "Dicas práticas sobre a seleção e uso do microscópio (segunda edição, 1878)" e também foi editor do "American Journal of Microscopy".

Exemplos de imagens de microscopia amadoras:

Aplicação em ciência forense

A microscopia tem muitas aplicações nas ciências forenses; ele fornece precisão, qualidade, exatidão e reprodutibilidade dos resultados. Esses aplicativos são quase ilimitados. Isso se deve à capacidade do microscópio de detectar, resolver e criar imagens dos menores itens de evidência, muitas vezes sem qualquer alteração ou destruição. O microscópio é usado para identificar e comparar fibras, cabelos, sujeira e poeira ... etc.

O objetivo de qualquer microscópio é ampliar imagens ou fotos de um pequeno objeto e ver pequenos detalhes. Em forense; o tipo de amostra, as informações que se deseja obter dela e o tipo de microscópio escolhido para a tarefa determinarão se a preparação da amostra é necessária. Por exemplo, linhas de tinta, manchas de sangue ou balas, nenhum tratamento é necessário e as evidências são mostradas diretamente do microscópio apropriado sem qualquer forma de preparação da amostra, mas para vestígios de uma matéria específica, a preparação da amostra deve ser feita antes que ocorra o exame microscópico.

Uma variedade de microscópios são usados ​​em laboratórios de ciência forense. Os microscópios de luz são os mais usados ​​em perícia e esses microscópios usam fótons para formar imagens 4 , esses microscópios que são mais aplicáveis ​​para o exame de espécimes forenses, conforme mencionado antes, são os seguintes:

1. O microscópio composto

2. O microscópio de comparação

3. O microscópio estereoscópico

4. O microscópio polarizador

5. O micro espectrofotômetro

Essa diversidade de tipos de microscópios em aplicações forenses vem principalmente de suas faixas de ampliação, que são (1-1200X), (50 -30.000X) e (500-250.000X) para microscopia óptica, MEV e TEM, respectivamente.

Veja também

Referências

Leitura adicional

links externos

Em geral
Técnicas