Cromatografia de íons - Ion chromatography

Um moderno sistema de cromatografia de íons

A cromatografia de íons (ou cromatografia de troca iônica ) separa íons e moléculas polares com base em sua afinidade com o trocador de íons . Ele funciona em quase qualquer tipo de molécula carregada - incluindo grandes proteínas , pequenos nucleotídeos e aminoácidos . No entanto, a cromatografia de íons deve ser feita em condições que estejam a uma unidade do ponto isoelétrico de uma proteína.

Os dois tipos de cromatografia de íons são troca aniônica e troca catiônica. A cromatografia de troca catiônica é usada quando a molécula de interesse está carregada positivamente. A molécula é carregada positivamente porque o pH para cromatografia é menor que o pI (a / k / a pH (I)). Nesse tipo de cromatografia, a fase estacionária é carregada negativamente e as moléculas carregadas positivamente são carregadas para serem atraídas por ela. A cromatografia de troca aniônica ocorre quando a fase estacionária está carregada positivamente e moléculas carregadas negativamente (o que significa que o pH para a cromatografia é maior do que o pI) são carregadas para serem atraídas por ela. É frequentemente usado na purificação de proteínas, análise de água e controle de qualidade. As moléculas solúveis em água e carregadas, como proteínas, aminoácidos e peptídeos, ligam-se a porções com carga oposta, formando ligações iônicas com a fase estacionária insolúvel. A fase estacionária equilibrada consiste em um grupo funcional ionizável onde as moléculas alvo de uma mistura a ser separada e quantificada podem se ligar enquanto passam pela coluna - uma fase estacionária catiônica é usada para separar ânions e uma fase estacionária aniônica é usada para separar cátions. A cromatografia de troca catiônica é usada quando as moléculas desejadas para separar são cátions e a cromatografia de troca aniônica é usada para separar ânions. As moléculas ligadas podem então ser eluídas e coletadas usando um eluente que contém ânions e cátions, executando uma concentração mais alta de íons através da coluna ou alterando o pH da coluna.

Uma das principais vantagens do uso da cromatografia de íons é apenas uma interação envolvida durante a separação, em oposição a outras técnicas de separação; portanto, a cromatografia de íons pode ter maior tolerância de matriz. Outra vantagem da troca iônica é a previsibilidade dos padrões de eluição (com base na presença do grupo ionizável). Por exemplo, quando a cromatografia de troca catiônica é usada, os cátions serão eluídos por último. Enquanto isso, as moléculas carregadas negativamente serão eliminadas primeiro. No entanto, também existem desvantagens envolvidas na realização da cromatografia de troca iônica, como a evolução constante com a técnica que leva à inconsistência de coluna para coluna. A principal limitação desta técnica de purificação é que ela é limitada ao grupo ionizável.

História

Cromatografia de troca iônica

A cromatografia iônica avançou com o acúmulo de conhecimento ao longo de muitos anos. A partir de 1947, Spedding e Powell usaram a cromatografia de troca iônica de deslocamento para a separação das terras raras. Além disso, eles mostraram a separação por troca iônica dos isótopos 14N e 15N da amônia. No início da década de 1950, Kraus e Nelson demonstraram o uso de muitos métodos analíticos para íons metálicos dependentes de sua separação de seus complexos de cloreto, fluoreto, nitrato ou sulfato por cromatografia de ânions. A detecção automática em linha foi introduzida progressivamente de 1960 a 1980, bem como novos métodos cromatográficos para separações de íons metálicos. Um método inovador de Small, Stevens e Bauman da Dow Chemical Co. desdobrou a criação da moderna cromatografia de íons. Ânions e cátions agora podem ser separados de forma eficiente por um sistema de detecção de condutividade suprimida. Em 1979, um método para cromatografia de ânions com detecção de condutividade não suprimida foi introduzido por Gjerde et al. Em seguida, em 1980, foi um método semelhante para cromatografia catiônica.

Como resultado, um período de extrema competição começou dentro do mercado de IC, com suportes para detecção de condutividade suprimida e não suprimida. Esta competição levou ao rápido crescimento de novas formas e à rápida evolução do IC. Um desafio que precisa ser superado no desenvolvimento futuro de CI é a preparação de colunas monolíticas de troca iônica altamente eficientes e superar esse desafio seria de grande importância para o desenvolvimento de CI.

O boom da cromatografia de troca iônica começou principalmente entre 1935–1950 durante a Segunda Guerra Mundial e foi por meio do " projeto Manhattan " que os aplicativos e IC foram significativamente estendidos. A cromatografia de íons foi originalmente introduzida por dois pesquisadores ingleses, o agrícola Sir Thompson e o químico JT Way. Os trabalhos de Thompson e Way envolveram a ação de sais de fertilizantes solúveis em água, sulfato de amônio e cloreto de potássio. Esses sais não podiam ser extraídos facilmente do solo devido à chuva. Eles realizaram métodos iônicos para tratar argilas com os sais, resultando na extração de amônia além da liberação de cálcio. Foi nas décadas de 1950 e 1960 que os modelos teóricos de IC foram desenvolvidos para maior compreensão e somente na década de 1970 que os detectores contínuos foram utilizados, abrindo caminho para o desenvolvimento da cromatografia de baixa pressão para a de alto desempenho. Somente em 1975 a "cromatografia de íons" foi estabelecida como um nome em referência às técnicas, e foi posteriormente usada como um nome para fins de marketing. Hoje, IC é importante para investigar sistemas aquosos, como água potável. É um método popular para analisar elementos ou complexos aniônicos que ajudam a resolver problemas ambientalmente relevantes. Da mesma forma, ele também tem grande utilidade na indústria de semicondutores .

Por causa das abundantes colunas de separação, sistemas de eluição e detectores disponíveis, a cromatografia se tornou o principal método para análise de íons.

Quando essa técnica foi desenvolvida inicialmente, ela era usada principalmente para tratamento de água. Desde 1935, a cromatografia de troca iônica rapidamente se manifestou em uma das técnicas mais alavancadas, com seus princípios sendo frequentemente aplicados à maioria dos campos da química, incluindo destilação, adsorção e filtração.

Princípio

Cromatograma de íons exibindo separação de ânions

A cromatografia de troca iônica separa as moléculas com base em seus respectivos grupos carregados. A cromatografia de troca iônica retém moléculas de analito na coluna com base nas interações coulômbicas (iônicas). A matriz da cromatografia de troca iônica consiste em íons carregados positiva e negativamente. Essencialmente, as moléculas sofrem interações eletrostáticas com cargas opostas na matriz de fase estacionária. A fase estacionária consiste em uma matriz imóvel que contém grupos funcionais ionizáveis ​​carregados ou ligantes. A superfície da fase estacionária exibe grupos funcionais iônicos (RX) que interagem com íons analitos de carga oposta. Para atingir a eletroneutralidade, essas cargas inertes se acoplam a contra-íons trocáveis ​​na solução. As moléculas ionizáveis ​​que devem ser purificadas competem com esses contra-íons trocáveis ​​pela ligação às cargas imobilizadas na fase estacionária. Essas moléculas ionizáveis ​​são retidas ou eluídas com base em sua carga. Inicialmente, as moléculas que não se ligam ou se ligam fracamente à fase estacionária são as primeiras a serem eliminadas. Condições alteradas são necessárias para a eluição das moléculas que se ligam à fase estacionária. A concentração dos contra-íons trocáveis, que competem com as moléculas pela ligação, pode ser aumentada ou o pH pode ser alterado. Uma mudança no pH afeta a carga nas moléculas particulares e, portanto, altera a ligação. As moléculas então começam a eluir com base nas mudanças em suas cargas a partir dos ajustes. Além disso, esses ajustes podem ser usados ​​para liberar a proteína de interesse. Além disso, a concentração de contra-íons pode ser gradualmente variada para separar moléculas ionizadas. Este tipo de eluição é denominado eluição gradiente. Por outro lado, a eluição em etapas pode ser usada em que a concentração de contra-íons varia em uma etapa. Este tipo de cromatografia é subdividido em cromatografia de troca catiônica e cromatografia de troca aniônica . As moléculas com carga positiva ligam-se às resinas de troca catiônica, enquanto as moléculas com carga negativa se ligam às resinas de troca aniônica. O composto iônico que consiste nas espécies catiônicas M + e na espécie aniônica B- pode ser retido pela fase estacionária.

A cromatografia de troca catiônica retém cátions carregados positivamente porque a fase estacionária exibe um grupo funcional carregado negativamente:

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A cromatografia de troca aniônica retém os ânions usando um grupo funcional carregado positivamente:

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Observe que a força iônica de C + ou A- na fase móvel pode ser ajustada para mudar a posição de equilíbrio, portanto, o tempo de retenção.

O cromatograma de íons mostra um cromatograma típico obtido com uma coluna de troca aniônica.

Procedimento

Antes que a cromatografia de troca iônica possa ser iniciada, ela deve ser equilibrada. A fase estacionária deve ser equilibrada com certos requisitos que dependem do experimento com o qual você está trabalhando. Uma vez equilibrados, os íons carregados na fase estacionária serão anexados aos seus íons trocáveis ​​carregados opostos. Íons trocáveis ​​como Cl- ou Na +. Em seguida, um tampão deve ser escolhido no qual a proteína desejada pode se ligar. Após o equilíbrio, a coluna precisa ser lavada. A fase de lavagem ajudará a eluir todas as impurezas que não se ligam à matriz, enquanto a proteína de interesse permanece ligada. Este tampão de amostra precisa ter o mesmo pH que o tampão usado para equilíbrio para ajudar a ligar as proteínas desejadas. Proteínas não carregadas serão eluídas para fora da coluna a uma velocidade semelhante ao tampão que flui através da coluna. Uma vez que a amostra foi carregada na coluna e a coluna foi lavada com o tampão para eluir todas as proteínas não desejadas, a eluição é realizada para eluir as proteínas desejadas que estão ligadas à matriz. As proteínas ligadas são eluídas utilizando um gradiente de concentração de sal linearmente crescente. Com o aumento da força iônica do tampão, os íons de sal irão competir com as proteínas desejadas para se ligar a grupos carregados na superfície do meio. Isso fará com que as proteínas desejadas sejam eluídas para fora da coluna. As proteínas que têm uma carga líquida baixa serão eluídas primeiro à medida que a concentração de sal aumenta, fazendo com que a força iônica aumente. Proteínas com carga líquida alta precisarão de uma força iônica mais alta para serem eluídas para fora da coluna. É possível realizar a cromatografia de troca iônica em massa, em camadas finas de meio, como placas de vidro ou plástico revestidas com uma camada da fase estacionária desejada, ou em colunas de cromatografia. A cromatografia de camada fina ou cromatografia em coluna compartilham semelhanças, pois ambas atuam dentro dos mesmos princípios governantes; há troca constante e frequente de moléculas conforme a fase móvel viaja ao longo da fase estacionária. Não é imperativo adicionar a amostra em volumes de minuto, pois as condições predeterminadas para a coluna de troca foram escolhidas de modo que haverá uma forte interação entre as fases móvel e estacionária. Além disso, o mecanismo do processo de eluição causará uma compartimentação das diferentes moléculas com base em suas respectivas características químicas. Esse fenômeno é devido a um aumento nas concentrações de sal no topo ou próximo ao topo da coluna, deslocando assim as moléculas naquela posição, enquanto as moléculas limitadas mais abaixo são liberadas em um ponto posterior quando a maior concentração de sal atinge aquela área. Esses princípios são os motivos pelos quais a cromatografia de troca iônica é um excelente candidato para as etapas iniciais de cromatografia em um procedimento de purificação complexo, pois pode produzir rapidamente pequenos volumes de moléculas alvo, independentemente de um maior volume inicial.

Câmara (esquerda) contém alta concentração de sal. Câmara agitada (direita) contém baixa concentração de sal. A agitação gradual causa a formação de um gradiente de sal à medida que o sal passa de altas para baixas concentrações.

Dispositivos comparativamente simples são freqüentemente usados ​​para aplicar contra-íons de gradiente crescente a uma coluna de cromatografia. Contra-íons como o cobre (II) são escolhidos mais frequentemente para separar efetivamente peptídeos e aminoácidos por meio da formação de complexos.

Um dispositivo simples pode ser usado para criar um gradiente de sal. O tampão de eluição está sendo consistentemente retirado da câmara para a câmara de mistura, alterando assim a concentração do tampão. Geralmente, o tampão colocado na câmara é geralmente de alta concentração inicial, enquanto o tampão colocado na câmara agitada é geralmente de baixa concentração. À medida que o tampão de alta concentração da câmara esquerda é misturado e puxado para a coluna, a concentração do tampão da coluna agitada aumenta gradualmente. Alterar as formas da câmara agitada, bem como do buffer de limite, permite a produção de gradientes côncavos, lineares ou convexos de contra-íons.

Uma infinidade de meios diferentes são usados ​​para a fase estacionária. Entre os grupos carregados imobilizados mais comuns usados ​​estão trimetilaminoetil (TAM), trietilaminoetil (TEAE), dietil-2-hidroxipropilaminoetil (QAE), aminoetil (AE), dietilaminoetil (DEAE), sulfo (S), sulfometil (SM), sulfopropil ( SP), carboxi (C) e carboximetil (CM).

O empacotamento bem-sucedido da coluna é um aspecto importante da cromatografia de íons. A estabilidade e a eficiência de uma coluna final dependem dos métodos de empacotamento, do solvente usado e dos fatores que afetam as propriedades mecânicas da coluna. Em contraste com os primeiros métodos ineficientes de empacotamento a seco, o empacotamento com pasta úmida, no qual as partículas suspensas em um solvente apropriado são distribuídas em uma coluna sob pressão, mostra uma melhoria significativa. Três abordagens diferentes podem ser empregadas na realização do empacotamento de pasta úmida: o método de densidade balanceada (a densidade do solvente é mais ou menos aquela das partículas de sílica porosa), o método de alta viscosidade (um solvente de alta viscosidade é usado) e o método de pasta de baixa viscosidade (realizado com solventes de baixa viscosidade).

O poliestireno é usado como meio de troca iônica. É feito a partir da polimerização do estireno com o uso de divinilbenzeno e peróxido de benzoíla. Esses trocadores formam interações hidrofóbicas com proteínas que podem ser irreversíveis. Devido a esta propriedade, os trocadores de íons de poliestireno não são adequados para a separação de proteínas. Por outro lado, eles são usados ​​para a separação de pequenas moléculas na separação de aminoácidos e remoção de sal da água. Os trocadores de íons de poliestireno com poros grandes podem ser usados ​​para a separação de proteínas, mas devem ser revestidos com uma substância hidrofílica.

O meio à base de celulose pode ser usado para a separação de moléculas grandes, pois elas contêm poros grandes. A ligação às proteínas neste meio é alta e tem baixo caráter hidrofóbico. DEAE é uma matriz de troca aniônica produzida a partir de um grupo lateral positivo de dietilaminoetil ligado à celulose ou Sephadex.

O meio à base de gel de agarose também contém poros grandes, mas sua capacidade de substituição é menor em comparação com os dextranos. A capacidade do meio de inchar em líquido é baseada na reticulação dessas substâncias, o pH e as concentrações de íons dos tampões usados.

A incorporação de alta temperatura e pressão permite um aumento significativo na eficiência da cromatografia iônica, juntamente com uma diminuição no tempo. A temperatura influencia a seletividade devido aos seus efeitos nas propriedades de retenção. O fator de retenção ( k = ( t _R ^g - t _M ^g ) / ( t _M ^g - t _ext )) aumenta com a temperatura para íons pequenos, e a tendência oposta é observada para íons maiores.

Apesar da seletividade de íons em diferentes meios, pesquisas adicionais estão sendo feitas para realizar a cromatografia de troca iônica na faixa de 40–175 ° C.

Um solvente apropriado pode ser escolhido com base em observações de como as partículas da coluna se comportam em um solvente. Usando um microscópio óptico, pode-se facilmente distinguir um estado disperso desejável de pasta de partículas agregadas.

Trocadores de íons fracos e fortes

Um trocador de íons "forte" não perderá a carga em sua matriz uma vez que a coluna esteja equilibrada e, portanto, uma ampla gama de tampões de pH pode ser usada. Os trocadores de íons "fracos" têm uma faixa de valores de pH em que manterão sua carga. Se o pH do tampão usado para uma coluna de troca iônica fraca sair da faixa de capacidade da matriz, a coluna perderá sua distribuição de carga e a molécula de interesse pode ser perdida. Apesar da faixa menor de pH dos trocadores de íons fracos, eles são frequentemente usados ​​em vez de trocadores de íons fortes devido a terem maior especificidade. Em alguns experimentos, os tempos de retenção de trocadores de íons fracos são longos o suficiente para obter os dados desejados com uma alta especificidade.

As resinas (frequentemente denominadas 'contas') de colunas de troca iônica podem incluir grupos funcionais, como ácidos fracos / fortes e bases fracas / fortes. Existem também colunas especiais que possuem resinas com grupos funcionais anfotéricos que podem trocar cátions e ânions. Alguns exemplos de grupos funcionais de resinas de troca iônica fortes são o cátion de amônio quaternário (Q), que é um trocador de ânions, e o ácido sulfônico (S, -SO ₂ OH), que é um trocador de cátions. Esses tipos de trocadores podem manter sua densidade de carga em uma faixa de pH de 0–14. Exemplos de grupos funcionais de resinas de troca iônica fraca incluem dietilaminoetil (DEAE, -C ₂ H ₄ N (CH ₂ H ₅ ) ₂ ), que é um trocador de ânions, e carboximetil (CM, -CH ₂ -COOH), que é um trocador de cátions. Esses dois tipos de trocadores podem manter a densidade de carga de suas colunas em um intervalo de pH de 5–9.

Na cromatografia de íons, a interação dos íons de soluto e a fase estacionária com base em suas cargas determina quais íons se ligarão e em que grau. Quando a fase estacionária apresenta grupos positivos que atraem ânions, é chamada de trocador de ânions; quando há grupos negativos na fase estacionária, os cátions são atraídos e é um trocador de cátions. A atração entre os íons e a fase estacionária também depende da resina, partículas orgânicas usadas como trocadores de íons.

Cada resina apresenta seletividade relativa que varia com base nos íons de soluto presentes que irão competir para se ligar ao grupo de resina na fase estacionária. O coeficiente de seletividade, o equivalente à constante de equilíbrio, é determinado por meio de uma razão das concentrações entre a resina e cada íon, no entanto, a tendência geral é que os trocadores de íons preferem se ligar ao íon com uma carga mais alta, raio hidratado menor e polarizabilidade mais alta, ou a capacidade da nuvem de elétrons de um íon ser interrompida por outras cargas. Apesar dessa seletividade, quantidades em excesso de um íon com uma seletividade inferior introduzida na coluna faria com que o íon menor se ligasse mais à fase estacionária, pois o coeficiente de seletividade permite flutuações na reação de ligação que ocorre durante a cromatografia de troca iônica.

A tabela a seguir mostra os trocadores de íons comumente usados

Técnica típica

Uma amostra é introduzida, manualmente ou com um amostrador automático , em um loop de amostra de volume conhecido. Uma solução aquosa tamponada conhecida como fase móvel carrega a amostra do loop para uma coluna que contém alguma forma de material de fase estacionária. Esta é tipicamente uma matriz de resina ou gel que consiste em grânulos de agarose ou celulose com grupos funcionais carregados covalentemente ligados. O equilíbrio da fase estacionária é necessário para obter a carga desejada da coluna. Se a coluna não estiver devidamente equilibrada, a molécula desejada pode não se ligar fortemente à coluna. Os analitos alvo (ânions ou cátions) são retidos na fase estacionária, mas podem ser eluídos aumentando a concentração de uma espécie com carga semelhante que desloca os íons analitos da fase estacionária. Por exemplo, na cromatografia de troca catiônica, o analito carregado positivamente pode ser deslocado pela adição de íons de sódio carregados positivamente. Os analitos de interesse devem então ser detectados por alguns meios, normalmente por condutividade ou absorvância de luz UV / visível.

O controle de um sistema IC geralmente requer um sistema de dados de cromatografia (CDS). Além dos sistemas IC, alguns desses CDSs também podem controlar a cromatografia gasosa (GC) e HPLC.

Cromatografia de troca de membrana

Um tipo de cromatografia de troca iônica, a troca por membrana é um método relativamente novo de purificação projetado para superar as limitações do uso de colunas cheias de contas. Os dispositivos cromatográficos de membrana são baratos para produção em massa e descartáveis, ao contrário de outros dispositivos cromatográficos que requerem manutenção e tempo para revalidar. Existem três tipos de absorvedores de membrana que são normalmente usados ​​na separação de substâncias. Os três tipos são folha plana, fibra oca e fluxo radial. O absorvedor mais comum e mais adequado para a cromatografia de membrana são várias folhas planas porque têm um volume de absorvente maior. Ele pode ser usado para superar as limitações de transferência de massa e queda de pressão, tornando-o especialmente vantajoso para isolar e purificar vírus, DNA de plasmídeo e outras macromoléculas grandes. A coluna é preenchida com membranas microporosas com poros internos que contêm porções adsortivas que podem se ligar à proteína alvo. As membranas adsortivas estão disponíveis em uma variedade de geometrias e químicas, o que permite que sejam usadas para purificação e também fracionamento, concentração e clarificação com uma eficiência 10 vezes maior que a do uso de grânulos. As membranas podem ser preparadas através do isolamento da própria membrana, onde as membranas são cortadas em quadrados e imobilizadas. Um método mais recente envolveu o uso de células vivas que são anexadas a uma membrana de suporte e são usadas para identificação e clarificação de moléculas de sinalização.

Proteínas de separação

Coluna de troca iônica em escala preparativa usada para purificação de proteínas .

A cromatografia de troca iônica pode ser usada para separar proteínas porque elas contêm grupos funcionais carregados. Os íons de interesse (neste caso, proteínas carregadas) são trocados por outros íons (geralmente H ⁺ ) em um suporte sólido carregado. Os solutos estão mais comumente em uma fase líquida, que tende a ser água. Tome, por exemplo, proteínas na água, que seria uma fase líquida que passa por uma coluna. A coluna é comumente conhecida como fase sólida, pois é preenchida com partículas sintéticas porosas que possuem uma determinada carga. Essas partículas porosas também são chamadas de grânulos, podem ser aminadas (contendo grupos amino) ou ter íons metálicos para ter uma carga. A coluna pode ser preparada usando polímeros porosos, para macromoléculas acima de 100.000 o tamanho ideal da partícula porosa é de cerca de 1 μm ² . Isso ocorre porque a difusão lenta dos solutos dentro dos poros não restringe a qualidade da separação. As contas contendo grupos carregados positivamente, que atraem as proteínas carregadas negativamente, são comumente referidas como resinas de troca aniônica. Os aminoácidos que possuem cadeias laterais carregadas negativamente em pH 7 (pH da água) são o glutamato e o aspartato. Os grânulos com carga negativa são chamados de resinas de troca catiônica, pois proteínas carregadas positivamente serão atraídas. Os aminoácidos que possuem cadeias laterais carregadas positivamente em pH 7 são lisina, histidina e arginina.

O ponto isoelétrico é o pH no qual um composto - neste caso uma proteína - não tem carga líquida. O ponto isoelétrico de uma proteína ou PI pode ser determinado usando o pKa das cadeias laterais, se o amino (cadeia positiva) for capaz de cancelar a cadeia carboxila (negativa), a proteína estaria em seu PI. Usar tampões em vez de água para proteínas que não têm carga em pH 7 é uma boa ideia, pois permite a manipulação do pH para alterar as interações iônicas entre as proteínas e os grânulos. Cadeias laterais fracamente ácidas ou básicas são capazes de ter uma carga se o pH for alto ou baixo o suficiente, respectivamente. A separação pode ser alcançada com base no ponto isoelétrico natural da proteína. Alternativamente, um tag de peptídeo pode ser adicionado geneticamente à proteína para dar à proteína um ponto isoelétrico longe da maioria das proteínas naturais (por exemplo, 6 argininas para ligação a uma resina de troca catiônica ou 6 glutamatos para ligação a uma resina de troca aniônica, como DEAE -Sepharose).

A eluição pelo aumento da força iônica da fase móvel é mais sutil. Funciona porque os íons da fase móvel interagem com os íons imobilizados na fase estacionária, "protegendo" a fase estacionária da proteína e deixando a proteína eluir.

A eluição a partir de colunas de permuta de iões pode ser sensível a alterações de um único charge- cromatofocagem . A cromatografia de troca iônica também é útil no isolamento de conjuntos de proteínas multiméricas específicas, permitindo a purificação de complexos específicos de acordo com o número e a posição dos marcadores de peptídeos carregados.

Efeito Gibbs-Donnan

Na cromatografia de troca iônica, o efeito Gibbs-Donnan é observado quando o pH do tampão aplicado e do trocador iônico diferem, mesmo até uma unidade de pH. Por exemplo, em colunas de troca aniônica, os trocadores de íons repelem prótons, de modo que o pH do tampão próximo à coluna difere é mais alto do que o resto do solvente. Como resultado, um experimentador deve ter cuidado para que a (s) proteína (s) de interesse sejam estáveis ​​e devidamente carregadas no pH "real".

Esse efeito vem como resultado de duas partículas com carga semelhante, uma da resina e outra da solução, que não se distribuem adequadamente entre os dois lados; há uma absorção seletiva de um íon sobre o outro. Por exemplo, em uma resina de poliestireno sulfonado, uma resina de troca catiônica, o íon cloro de um tampão de ácido clorídrico deve se equilibrar na resina. Porém, como a concentração do ácido sulfônico na resina é alta, o hidrogênio do HCl não tem tendência a entrar na coluna. Isso, combinado com a necessidade de eletroneutralidade, leva a uma quantidade mínima de hidrogênio e cloro entrando na resina.

Usos

Utilidade clínica

O uso da cromatografia de íons pode ser visto na cromatografia de argentação . Normalmente, a prata e os compostos contendo ligações acetilênicas e etilênicas têm interações muito fracas. Este fenômeno foi amplamente testado em compostos de olefinas. Os complexos iônicos que as olefinas fazem com os íons de prata são fracos e feitos com base na sobreposição dos orbitais pi, sigma e d e os elétrons disponíveis, portanto, não causam mudanças reais na ligação dupla. Esse comportamento foi manipulado para separar lipídios, principalmente ácidos graxos, de misturas em frações com número diferente de ligações duplas usando íons de prata. As resinas iônicas foram impregnadas com íons de prata, que foram então expostos a vários ácidos (ácido silícico) para eluir ácidos graxos de diferentes características.

Limites de detecção tão baixos quanto 1 μM podem ser obtidos para íons de metais alcalinos. Pode ser usado para medição de HbA1c , porfirina e com purificação de água . As Resinas de Troca Iônica (IER) têm sido amplamente utilizadas principalmente em medicamentos devido à sua alta capacidade e ao sistema descomplicado do processo de separação. Um dos usos sintéticos é usar resinas de troca iônica para diálise renal. Este método é usado para separar os elementos do sangue usando o rim artificial com membrana de celulose.

Outra aplicação clínica da cromatografia de íons é a técnica de cromatografia de troca aniônica rápida usada para separar as isoenzimas da creatina quinase (CK) do soro humano e do tecido proveniente de material de autópsia (principalmente tecidos ricos em CK, como músculo cardíaco e cérebro). Estas isoenzimas incluem MM, MB e BB, que desempenham a mesma função dadas diferentes sequências de aminoácidos. As funções dessas isoenzimas são converter a creatina, usando ATP, em ADP que expele fosfocreatina. As minicolunas foram preenchidas com DEAE-Sephadex A-50 e posteriormente eluídas com tampão tris-cloreto de sódio em várias concentrações (cada concentração foi escolhida com vantagem para manipular a eluição). O extrato de tecido humano foi inserido em colunas para separação. Todas as frações foram analisadas para ver a atividade total de CK e verificou-se que cada fonte de isoenzimas CK tinha isoenzimas características encontradas dentro delas. Primeiramente, CK-MM foi eluído, depois CK-MB, seguido de CK-BB. Portanto, as isoenzimas encontradas em cada amostra poderiam ser utilizadas para identificar a fonte, visto que eram específicas do tecido.

Usando as informações dos resultados, a correlação pode ser feita sobre o diagnóstico dos pacientes e o tipo de isoenzimas CK encontradas na atividade mais abundante. A partir da descoberta, cerca de 35 dos 71 pacientes estudados sofreram de ataque cardíaco (enfarte do miocárdio) também continham uma quantidade abundante das isoenzimas CK-MM e CK-MB. As descobertas mostram ainda que muitos outros diagnósticos, incluindo insuficiência renal, doença cerebrovascular e doença pulmonar, apresentavam apenas a isoenzima CK-MM e nenhuma outra isoenzima. Os resultados deste estudo indicam correlações entre várias doenças e as isoenzimas CK encontradas, o que confirma resultados de testes anteriores usando várias técnicas. Os estudos sobre CK-MB encontrados em vítimas de ataque cardíaco se expandiram desde este estudo e aplicação da cromatografia iônica.

Aplicações industriais

Desde 1975, a cromatografia de íons tem sido amplamente utilizada em muitos ramos da indústria. As principais vantagens benéficas são confiabilidade, exatidão e precisão muito boas, alta seletividade, alta velocidade, alta eficiência de separação e baixo custo de consumíveis. O desenvolvimento mais significativo relacionado à cromatografia de íons são os novos métodos de preparação de amostras; melhorando a velocidade e seletividade da separação de analitos; redução dos limites de detecção e limites de quantificação; ampliação do escopo de aplicações; desenvolvimento de novos métodos padrão; miniaturização e ampliação do escopo de análise de um novo grupo de substâncias. Permite o teste quantitativo de eletrólitos e aditivos proprietários de banhos de galvanoplastia . É um avanço do teste qualitativo da célula do casco ou teste de UV menos preciso. Íons, catalisadores, abrilhantadores e aceleradores podem ser medidos. A cromatografia de troca iônica gradualmente se tornou uma técnica amplamente conhecida e universal para a detecção de espécies aniônicas e catiônicas. Aplicativos para tais fins foram desenvolvidos, ou estão em desenvolvimento, para uma variedade de campos de interesse e, em particular, para a indústria farmacêutica. O uso da cromatografia de troca iônica em produtos farmacêuticos aumentou nos últimos anos e, em 2006, um capítulo sobre cromatografia de troca iônica foi oficialmente adicionado ao Formulário Nacional da Farmacopia dos Estados Unidos (USP-NF). Além disso, no lançamento de 2009 do USP-NF, a Farmacopia dos Estados Unidos disponibilizou várias análises de cromatografia de íons usando duas técnicas: detecção de condutividade, bem como detecção amperométrica de pulso . A maioria dessas aplicações é usada principalmente para medir e analisar os limites residuais em produtos farmacêuticos, incluindo a detecção dos limites de oxalato, iodeto, sulfato, sulfamato, fosfato, bem como vários eletrólitos, incluindo potássio e sódio. No total, a edição de 2009 do USP-NF lançou oficialmente vinte e oito métodos de detecção para a análise de compostos ativos, ou componentes de compostos ativos, usando detecção de condutividade ou detecção amperométrica de pulso.

Desenvolvimento de drogas

Um sistema de cromatografia de íons usado para detectar e medir cátions como sódio, amônio e potássio em formulações para tosse de expectorante.

Tem havido um interesse crescente na aplicação do CI na análise de fármacos. IC é usado em diferentes aspectos do desenvolvimento de produtos e testes de controle de qualidade. Por exemplo, IC é usado para melhorar as propriedades de estabilidade e solubilidade de moléculas de drogas farmacêuticas ativas, bem como usado para detectar sistemas que têm maior tolerância a solventes orgânicos. IC foi usado para a determinação de analitos como parte de um teste de dissolução. Por exemplo, testes de dissolução de cálcio mostraram que outros íons presentes no meio podem ser bem resolvidos entre si e também a partir do íon cálcio. Portanto, o IC tem sido empregado em medicamentos na forma de comprimidos e cápsulas para determinar a quantidade de medicamento que se dissolve com o tempo. IC também é amplamente utilizado para detecção e quantificação de excipientes ou ingredientes inativos usados ​​em formulações farmacêuticas. A detecção de açúcar e álcool de açúcar em tais formulações por meio de IC tem sido feita devido a esses grupos polares serem resolvidos na coluna de íons. Metodologia IC também estabelecida na análise de impurezas em substâncias e produtos medicamentosos. Impurezas ou quaisquer componentes que não façam parte da entidade química do medicamento são avaliados e fornecem informações sobre as quantidades máximas e mínimas de medicamento que devem ser administradas a um paciente por dia.

Veja também

• Cromatografia de troca aniônica
• Cromatofocagem
• Cromatografia líquida de alta performance
• Ponto de isolação eletrica

Referências

Bibliografia

• Small, Hamish (1989). Cromatografia de íons . Nova York: Plenum Press. ISBN 978-0-306-43290-3.
• Tatjana Weiss; Weiss, Joachim (2005). Handbook of Ion Chromatography . Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 978-3-527-28701-7.
• Gjerde, Douglas T .; Fritz, James S. (2000). Cromatografia de íons . Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 978-3-527-29914-0.
• Jackson, Peter; Haddad, Paul R. (1990). Cromatografia iônica: princípios e aplicações . Amsterdã: Elsevier. ISBN 978-0-444-88232-5.
• Mercer, Donald W. (1974). "Separação de isoenzimas de creatina quinase de tecido e soro por cromatografia em coluna de troca iônica" . Química Clínica . 20 (1): 36–40. doi : 10.1093 / clinchem / 20.1.36 . PMID  4809470 .
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• Ghosh, Raja (2002). "Separação de proteínas usando cromatografia de membrana: oportunidades e desafios". Journal of Chromatography A . 952 (1): 13–27. doi : 10.1016 / s0021-9673 (02) 00057-2 . PMID  12064524 .

links externos

• Mídia relacionada à cromatografia de íons no Wikimedia Commons

• LC Instruments em Curlie