Cromatografia líquida de alta performance - High-performance liquid chromatography

Cromatografia líquida de alta performance
Hplc.JPG
Uma configuração de HPLC; Da esquerda para a direita: Um dispositivo de bombeamento que gera um gradiente de dois solventes diferentes - uma coluna reforçada com aço e um detector para medir a absorbância.
Acrônimo HPLC
Classificação Cromatografia
Analitos polímeros de íons de
biomoléculas de moléculas orgânicas

Outras técnicas
Relacionado Cromatografia Cromatografia
de fase normal aquosa Cromatografia de
interação hidrofílica Cromatografia de
troca iônica Cromatografia de
exclusão de tamanho Cromatografia
líquida micelar
Hifenizado Cromatografia líquida-espectrometria de massa
Um HPLC moderno e independente.
Representação esquemática de uma unidade de HPLC. (1) Reservatórios de solvente, (2) Desgaseificador de solvente, (3) Válvula de gradiente, (4) Recipiente de mistura para entrega da fase móvel, (5) Bomba de alta pressão, (6) Válvula de comutação na "posição de injeção", ( 6 ') Válvula de comutação na "posição de carga", (7) Loop de injeção de amostra, (8) Pré-coluna (coluna de guarda), (9) Coluna analítica, (10) Detector ( ou seja , IR, UV), (11) Aquisição de dados, (12) Coletor de resíduos ou frações.

A cromatografia líquida de alto desempenho ( HPLC ), anteriormente conhecida como cromatografia líquida de alta pressão , é uma técnica em química analítica usada para separar, identificar e quantificar cada componente de uma mistura. Ele depende de bombas para passar um solvente líquido pressurizado contendo a mistura de amostra por uma coluna preenchida com um material adsorvente sólido . Cada componente da amostra interage de maneira ligeiramente diferente com o material adsorvente, causando diferentes taxas de fluxo para os diferentes componentes e levando à separação dos componentes à medida que fluem para fora da coluna.

HPLC tem sido usado para fabricação ( por exemplo , durante o processo de produção de produtos farmacêuticos e biológicos), legal ( por exemplo , detecção de drogas para melhorar o desempenho na urina), pesquisa ( por exemplo , separar os componentes de uma amostra biológica complexa ou de produtos químicos sintéticos semelhantes uns dos outros) e para fins médicos ( por exemplo , detectar os níveis de vitamina D no soro do sangue).

A cromatografia pode ser descrita como um processo de transferência de massa envolvendo adsorção . O HPLC depende de bombas para passar um líquido pressurizado e uma mistura de amostra por uma coluna cheia de adsorvente, levando à separação dos componentes da amostra. O componente ativo da coluna, o adsorvente, é tipicamente um material granular feito de partículas sólidas ( por exemplo , sílica , polímeros, etc.), com 2–50 µm de tamanho. Os componentes da mistura da amostra são separados uns dos outros devido aos seus diferentes graus de interação com as partículas adsorventes. O líquido pressurizado é tipicamente uma mistura de solventes ( por exemplo , água, acetonitrila e / ou metanol) e é referido como uma "fase móvel". Sua composição e temperatura desempenham um papel importante no processo de separação, influenciando as interações que ocorrem entre os componentes da amostra e o adsorvente. Essas interações são de natureza física, como hidrofóbica (dispersiva), dipolo-dipolo e iônica, na maioria das vezes uma combinação.

A HPLC se distingue da cromatografia líquida tradicional ("baixa pressão") porque as pressões operacionais são significativamente mais altas (50–350 bar), enquanto a cromatografia líquida comum normalmente depende da força da gravidade para passar a fase móvel através da coluna. Devido à pequena quantidade de amostra separada em HPLC analítico, as dimensões típicas da coluna são de 2,1–4,6 mm de diâmetro e 30–250 mm de comprimento. Além disso, as colunas de HPLC são feitas com partículas adsorventes menores (2–50 μm em tamanho médio de partícula). Isso dá ao HPLC um poder de resolução superior (a capacidade de distinguir entre compostos) ao separar misturas, o que o torna uma técnica cromatográfica popular.

O esquema de um instrumento de HPLC normalmente inclui um desgaseificador, amostrador, bombas e um detector. O amostrador traz a mistura da amostra para o fluxo da fase móvel que a carrega para a coluna. As bombas fornecem o fluxo desejado e a composição da fase móvel através da coluna. O detector gera um sinal proporcional à quantidade de componente da amostra que emerge da coluna, permitindo, assim, a análise quantitativa dos componentes da amostra. Um microprocessador digital e um software de usuário controlam o instrumento HPLC e fornecem análise de dados. Alguns modelos de bombas mecânicas em um instrumento de HPLC podem misturar vários solventes em proporções que mudam com o tempo, gerando um gradiente de composição na fase móvel. Vários detectores são de uso comum, como UV / Vis , matriz de fotodiodo (PDA) ou baseados em espectrometria de massa . A maioria dos instrumentos de HPLC também possui um forno de coluna que permite ajustar a temperatura na qual a separação é realizada.

Operação

A mistura da amostra a ser separada e analisada é introduzida, em um pequeno volume discreto (tipicamente microlitros), na corrente de fase móvel que percola através da coluna. Os componentes da amostra se movem pela coluna em velocidades diferentes, que são função de interações físicas específicas com o adsorvente (também chamada de fase estacionária). A velocidade de cada componente depende da sua natureza química, da natureza da fase estacionária (coluna) e da composição da fase móvel. O momento em que um analito específico elui (emerge da coluna) é chamado de tempo de retenção. O tempo de retenção medido sob condições particulares é uma característica identificadora de um determinado analito.

Muitos tipos diferentes de colunas estão disponíveis, preenchidas com adsorventes variando em tamanho de partícula, porosidade e química de superfície. O uso de materiais de empacotamento de menor tamanho de partícula requer o uso de pressão operacional mais alta ("contrapressão") e normalmente melhora a resolução cromatográfica (o grau de separação de pico entre analitos consecutivos emergindo da coluna). As partículas de sorvente podem ser hidrofóbicas ou polares por natureza.

As fases móveis comuns usadas incluem qualquer combinação miscível de água com vários solventes orgânicos (os mais comuns são acetonitrila e metanol ). Algumas técnicas de HPLC usam fases móveis sem água (consulte a cromatografia de fase normal abaixo). O componente aquoso da fase móvel pode conter ácidos (tais como ácido fórmico, fosfórico ou trifluoroacético ) ou sais para auxiliar na separação dos componentes da amostra. A composição da fase móvel pode ser mantida constante ("modo de eluição isocrática") ou variada ("modo de eluição em gradiente") durante a análise cromatográfica. A eluição isocrática é tipicamente eficaz na separação de componentes da amostra que são muito diferentes em sua afinidade com a fase estacionária. Na eluição de gradiente, a composição da fase móvel varia tipicamente de força de eluição baixa a alta. A força de eluição da fase móvel é refletida pelos tempos de retenção do analito com alta força de eluição produzindo uma eluição rápida (= tempos de retenção curtos). Um perfil de gradiente típico em cromatografia de fase reversa pode começar com 5% de acetonitrila (em água ou tampão aquoso) e progredir linearmente para 95% de acetonitrila ao longo de 5–25 minutos. Períodos de composição de fase móvel constante podem fazer parte de qualquer perfil de gradiente. Por exemplo, a composição da fase móvel pode ser mantida constante em 5% de acetonitrila por 1–3 min, seguido por uma mudança linear de até 95% de acetonitrila.

Um coletor de frações rotativo que coleta a saída de HPLC. O sistema está sendo usado para isolar uma fração contendo o Complexo I das membranas plasmáticas de E. coli . Foram necessários cerca de 50 litros de bactérias para isolar essa quantidade.

A composição escolhida da fase móvel depende da intensidade das interações entre os vários componentes da amostra ("analitos") e da fase estacionária ( por exemplo , interações hidrofóbicas em HPLC de fase reversa). Dependendo de sua afinidade com as fases estacionária e móvel, os analitos são divididos entre as duas durante o processo de separação que ocorre na coluna. Este processo de partição é semelhante ao que ocorre durante uma extração líquido-líquido, mas é contínuo, não passo a passo. Neste exemplo, usando um gradiente de água / acetonitrila, mais componentes hidrofóbicos irão eluir (sair da coluna) tarde, uma vez que a fase móvel fica mais concentrada em acetonitrila ( isto é , em uma fase móvel de maior força de eluição).

A escolha dos componentes da fase móvel, aditivos (como sais ou ácidos) e condições do gradiente depende da natureza da coluna e dos componentes da amostra. Freqüentemente, uma série de ensaios é realizada com a amostra a fim de encontrar o método de HPLC que forneça uma separação adequada.

História e desenvolvimento

Antes do HPLC, os cientistas usavam técnicas de cromatografia líquida padrão. Os sistemas cromatográficos líquidos eram amplamente ineficientes devido à taxa de fluxo dos solventes ser dependente da gravidade. As separações levavam muitas horas, às vezes dias, para serem concluídas. A cromatografia gasosa (GC) na época era mais poderosa do que a cromatografia líquida (LC), no entanto, acreditava-se que a separação da fase gasosa e a análise de biopolímeros muito polares de alto peso molecular eram impossíveis. GC foi ineficaz para muitos bioquímicos por causa da instabilidade térmica dos solutos. Como resultado, métodos alternativos foram levantados, o que logo resultaria no desenvolvimento de HPLC.

Seguindo o trabalho seminal de Martin e Synge em 1941, foi previsto por Cal Giddings, Josef Huber e outros na década de 1960 que o LC poderia ser operado no modo de alta eficiência reduzindo o diâmetro da partícula de empacotamento substancialmente abaixo do LC típico (e GC) nível de 150 μm e usando pressão para aumentar a velocidade da fase móvel. Essas previsões passaram por extensa experimentação e refinamento ao longo dos anos 60 e 70. As primeiras pesquisas de desenvolvimento começaram a melhorar as partículas LC, e a invenção do Zipax, uma partícula superficialmente porosa, foi promissora para a tecnologia HPLC.

A década de 1970 trouxe muitos desenvolvimentos em hardware e instrumentação. Os pesquisadores começaram a usar bombas e injetores para fazer um projeto rudimentar de um sistema HPLC. As bombas amplificadoras de gás eram ideais porque operavam a pressão constante e não exigiam vedações sem vazamentos ou válvulas de retenção para fluxo constante e boa quantificação. Marcos de hardware foram alcançados na Dupont IPD (Divisão de Polímeros Industriais), como um dispositivo gradiente de baixo volume de permanência sendo utilizado, bem como a substituição do injetor de septo por uma válvula de injeção em loop.

Embora o desenvolvimento da instrumentação tenha sido importante, a história do HPLC é principalmente sobre a história e a evolução da tecnologia de partículas . Após a introdução de partículas de camada porosa, tem havido uma tendência constante para reduzir o tamanho das partículas para melhorar a eficiência. No entanto, ao diminuir o tamanho das partículas, surgiram novos problemas. As desvantagens práticas decorrem da queda excessiva de pressão necessária para forçar o fluido móvel através da coluna e da dificuldade de preparar um empacotamento uniforme de materiais extremamente finos. Cada vez que o tamanho da partícula é reduzido significativamente, outra rodada de desenvolvimento do instrumento geralmente deve ocorrer para lidar com a pressão.

Tipos

Cromatografia de partição

Alcance Útil da Técnica de Partição HILIC

A cromatografia de partição foi um dos primeiros tipos de cromatografia que os químicos desenvolveram. O princípio do coeficiente de partição foi aplicado em aplicações de cromatografia de papel , cromatografia de camada fina , fase gasosa e separação líquido-líquido . O Prêmio Nobel de Química de 1952 foi ganho por Archer John Porter Martin e Richard Laurence Millington Synge pelo desenvolvimento da técnica, que foi usada para a separação de aminoácidos . A cromatografia de partição usa um solvente retido, na superfície ou dentro dos grãos ou fibras de uma matriz de suporte sólido "inerte", como na cromatografia em papel ; ou tira vantagem de alguma interação coulômbica e / ou doadora de hidrogênio com a fase estacionária. As moléculas de analito dividem entre uma fase estacionária líquida e o eluente. Assim como na Cromatografia de Interação Hidrofílica (HILIC; uma subtécnica em HPLC), este método separa analitos com base nas diferenças em sua polaridade. HILIC geralmente usa uma fase estacionária polar ligada e uma fase móvel feita principalmente de acetonitrila com água como o componente forte. A HPLC de partição tem sido usada historicamente em suportes de sílica ou alumina não ligados. Cada um funciona de forma eficaz para separar analitos por diferenças polares relativas. As fases ligadas por HILIC têm a vantagem de separar solutos ácidos , básicos e neutros em uma única corrida cromatográfica.

Os analitos polares se difundem em uma camada de água estacionária associada à fase estacionária polar e, portanto, são retidos. Quanto mais fortes forem as interações entre o analito polar e a fase estacionária polar (em relação à fase móvel), maior será o tempo de eluição. A força de interação depende da parte dos grupos funcionais da estrutura molecular do analito, com grupos mais polarizados ( por exemplo , hidroxil-) e grupos capazes de ligações de hidrogênio induzindo mais retenção. As interações coulômbicas (eletrostáticas) também podem aumentar a retenção. O uso de solventes mais polares na fase móvel diminuirá o tempo de retenção dos analitos, ao passo que solventes mais hidrofóbicos tendem a aumentar os tempos de retenção.

Cromatografia de fase normal

A cromatografia de fase normal foi um dos primeiros tipos de HPLC desenvolvidos pelos químicos. Também conhecido como HPLC de fase normal (NP-HPLC), este método separa analitos com base em sua afinidade por uma superfície estacionária polar, como a sílica, portanto, é baseado na capacidade do analito de se envolver em interações polares (como ligação de hidrogênio ou dipolo tipo dipolo de interações) com a superfície do sorvente. NP-HPLC usa uma fase móvel não polar e não aquosa ( por exemplo , clorofórmio ) e funciona de forma eficaz para separar analitos prontamente solúveis em solventes não polares. O analito se associa e é retido pela fase estacionária polar. As forças de adsorção aumentam com o aumento da polaridade do analito. A força de interação depende não apenas dos grupos funcionais presentes na estrutura da molécula do analito, mas também de fatores estéricos . O efeito do impedimento estérico na força de interação permite que este método resolva (separar) isômeros estruturais .

O uso de solventes mais polares na fase móvel diminuirá o tempo de retenção dos analitos, enquanto os solventes mais hidrofóbicos tendem a induzir uma eluição mais lenta (tempos de retenção aumentados). Solventes muito polares, como traços de água na fase móvel, tendem a se adsorver à superfície sólida da fase estacionária, formando uma camada de ligação estacionária (água) que é considerada como tendo um papel ativo na retenção. Este comportamento é um tanto peculiar à cromatografia de fase normal porque é governado quase exclusivamente por um mecanismo adsortivo ( ou seja , os analitos interagem com uma superfície sólida em vez de com a camada solvatada de um ligante anexado à superfície do sorvente; consulte também HPLC de fase reversa abaixo ) A cromatografia de adsorção ainda é amplamente usada para separações de isômeros estruturais em formatos de cromatografia de coluna e camada fina em suportes de sílica ou alumina ativados (secos).

Partition- e NP-HPLC caiu em desgraça nos anos 1970 com o desenvolvimento de -fase reversa de HPLC por causa da pobre reprodutibilidade de tempos de retenção, devido à presença de uma camada de água ou de solvente orgânico prótico na superfície da sílica ou de alumina meios cromatográficos . Esta camada muda com qualquer mudança na composição da fase móvel ( por exemplo , nível de umidade) causando tempos de retenção flutuantes.

Recentemente, a cromatografia de partição tornou-se popular novamente com o desenvolvimento de fases ligadas Hilic que demonstram reprodutibilidade melhorada e devido a um melhor entendimento da faixa de utilidade da técnica.

Cromatografia de deslocamento

O princípio básico da cromatografia de deslocamento é: Uma molécula com alta afinidade para a matriz de cromatografia (o deslocador) competirá efetivamente pelos locais de ligação e, assim, deslocará todas as moléculas com afinidades menores. Existem diferenças distintas entre cromatografia de deslocamento e eluição. No modo de eluição, as substâncias normalmente emergem de uma coluna em picos estreitos de Gauss. Uma ampla separação de picos, de preferência até a linha de base, é desejada de modo a atingir a purificação máxima. A velocidade na qual qualquer componente de uma mistura viaja pela coluna no modo de eluição depende de muitos fatores. Mas para que duas substâncias viajem em velocidades diferentes e, portanto, sejam resolvidas, deve haver diferenças substanciais em alguma interação entre as biomoléculas e a matriz de cromatografia. Os parâmetros operacionais são ajustados para maximizar o efeito dessa diferença. Em muitos casos, a separação da linha de base dos picos pode ser alcançada apenas com eluição de gradiente e carregamentos de coluna baixos. Assim, duas desvantagens da cromatografia de modo de eluição, especialmente na escala preparativa, são a complexidade operacional, devido ao bombeamento de solvente de gradiente, e o baixo rendimento, devido aos baixos carregamentos de coluna. A cromatografia de deslocamento tem vantagens sobre a cromatografia de eluição em que os componentes são resolvidos em zonas consecutivas de substâncias puras em vez de “picos”. Como o processo tira vantagem da não linearidade das isotérmicas, uma alimentação de coluna maior pode ser separada em uma determinada coluna com os componentes purificados recuperados em uma concentração significativamente maior.

Cromatografia de fase reversa (RPC)

Um cromatograma de mistura complexa (água perfume) obtido por HPLC de fase reversa

HPLC de fase reversa (RP-HPLC) tem uma fase estacionária apolar e uma fase móvel aquosa moderadamente polar. Uma fase estacionária comum é uma sílica que foi modificada na superfície com RMe 2 SiCl , onde R é um grupo alquil de cadeia linear, como C 18 H 37 ou C 8 H 17 . Com essas fases estacionárias, o tempo de retenção é maior para moléculas que são menos polares, enquanto as moléculas polares eluem mais facilmente (no início da análise). Um investigador pode aumentar os tempos de retenção adicionando mais água à fase móvel; tornando assim a afinidade do analito hidrofóbico para a fase estacionária hidrofóbica mais forte em relação à fase móvel agora mais hidrofílica. Da mesma forma, um investigador pode diminuir o tempo de retenção adicionando mais solvente orgânico ao eluente. RP-HPLC é tão comumente usado que muitas vezes é incorretamente referido como "HPLC" sem outras especificações. A indústria farmacêutica regularmente emprega RP-HPLC para qualificar os medicamentos antes de seu lançamento.

O RP-HPLC opera com base no princípio das interações hidrofóbicas, que se originam da alta simetria na estrutura dipolar da água e desempenha o papel mais importante em todos os processos das ciências da vida. RP-HPLC permite a medição dessas forças interativas. A ligação do analito à fase estacionária é proporcional à área de superfície de contato em torno do segmento apolar da molécula do analito após associação com o ligante na fase estacionária. Este efeito solvofóbico é dominado pela força da água para a "redução da cavidade" em torno do analito e da cadeia C 18 versus o complexo de ambos. A energia liberada neste processo é proporcional à tensão superficial do eluente (água: 7,3 × 10 −6  J / cm², metanol: 2,2 × 10 −6  J / cm²) e à superfície hidrofóbica do analito e do ligante, respectivamente . A retenção pode ser diminuída pela adição de um solvente menos polar (metanol, acetonitrila ) na fase móvel para reduzir a tensão superficial da água. A eluição de gradiente usa este efeito reduzindo automaticamente a polaridade e a tensão superficial da fase móvel aquosa durante o curso da análise.

As propriedades estruturais da molécula do analito desempenham um papel importante em suas características de retenção. Em geral, um analito com uma área de superfície hidrofóbica maior (C – H, C – C e ligações atômicas geralmente não polares, como SS e outras) é retido por mais tempo porque não está interagindo com a estrutura da água. Por outro lado, analitos com maior área de superfície polar (conferida pela presença de grupos polares, como -OH, -NH 2 , COO - ou -NH 3 + em sua estrutura) são menos retidos, pois estão melhor integrados à água . Tais interações estão sujeitas a efeitos estéricos em que moléculas muito grandes podem ter apenas acesso restrito aos poros da fase estacionária, onde ocorrem as interações com ligantes de superfície (cadeias alquil). Esse obstáculo de superfície normalmente resulta em menos retenção.

O tempo de retenção aumenta com a área de superfície hidrofóbica (não polar). Os compostos de cadeia ramificada eluem mais rapidamente do que seus isômeros lineares correspondentes porque a área de superfície total é diminuída. Da mesma forma, compostos orgânicos com ligações C – C simples eluem mais tarde do que aqueles com ligação tripla C = C ou C – C, pois a ligação dupla ou tripla é mais curta do que uma ligação C – C simples.

Além da tensão superficial da fase móvel (força organizacional na estrutura do eluente), outros modificadores da fase móvel podem afetar a retenção do analito. Por exemplo, a adição de sais inorgânicos causa um aumento linear moderado na tensão superficial de soluções aquosas (ca. 1,5 × 10 −7  J / cm² por Mol para NaCl, 2,5 × 10 −7  J / cm² por Mol para (NH 4 ) 2 SO 4 ), e como a entropia da interface analito-solvente é controlada pela tensão superficial, a adição de sais tende a aumentar o tempo de retenção. Esta técnica é usada para separação e recuperação moderada de proteínas e proteção de sua atividade biológica na análise de proteínas (cromatografia de interação hidrofóbica, HIC).

Outro fator importante é o pH da fase móvel, pois pode alterar o caráter hidrofóbico do analito. Por esse motivo, a maioria dos métodos usa um agente tamponante , como o fosfato de sódio , para controlar o pH. Os tampões têm várias finalidades: controlar o pH, neutralizar a carga na superfície da sílica da fase estacionária e agir como agentes de emparelhamento iônico para neutralizar a carga do analito. O formato de amônio é comumente adicionado em espectrometria de massa para melhorar a detecção de certos analitos pela formação de adutos analito-amônio . Um ácido orgânico volátil, como ácido acético , ou mais comumente ácido fórmico , é frequentemente adicionado à fase móvel se a espectrometria de massa for usada para analisar o eluente da coluna. O ácido trifluoroacético é usado raramente em aplicações de espectrometria de massa devido à sua persistência no detector e no sistema de distribuição de solvente, mas pode ser eficaz na melhoria da retenção de analitos, como ácidos carboxílicos em aplicações que utilizam outros detectores, pois é um ácido orgânico bastante forte. Os efeitos dos ácidos e tampões variam de acordo com a aplicação, mas geralmente melhoram a resolução cromatográfica.

As colunas de fase reversa são muito difíceis de danificar em comparação com as colunas de sílica normais; no entanto, muitas colunas de fase reversa consistem em partículas de sílica derivadas de alquil e nunca devem ser usadas com bases aquosas , pois elas destruirão a partícula de sílica subjacente. Eles podem ser usados ​​com ácido aquoso, mas a coluna não deve ser exposta ao ácido por muito tempo, pois pode corroer as partes metálicas do equipamento de HPLC. As colunas RP-HPLC devem ser enxaguadas com solvente limpo após o uso para remover ácidos residuais ou tampões e armazenadas em uma composição apropriada de solvente. O conteúdo de metal das colunas de HPLC deve ser mantido baixo para que a melhor capacidade possível para separar as substâncias seja mantida. Um bom teste para o conteúdo de metal de uma coluna é injetar uma amostra que é uma mistura de 2,2'- e 4,4'- bipiridina . Porque o 2,2'-bipy pode quelar o metal, a forma do pico para o 2,2'-bipy será distorcida (cauda) quando os íons de metal estão presentes na superfície da sílica ...

Cromatografia de exclusão de tamanho

A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), também conhecida como cromatografia de permeação em gel ou cromatografia de filtração em gel , separa as partículas com base no tamanho molecular (na verdade, pelo raio de Stokes de uma partícula ). Geralmente é uma cromatografia de baixa resolução e, portanto, é muitas vezes reservada para a etapa final de "polimento" da purificação. Também é útil para determinar a estrutura terciária e a estrutura quaternária de proteínas purificadas. SEC é usado principalmente para a análise de grandes moléculas, como proteínas ou polímeros. O SEC funciona prendendo essas moléculas menores nos poros de uma partícula. As moléculas maiores simplesmente passam pelos poros, pois são muito grandes para entrar neles. Moléculas maiores, portanto, fluem pela coluna mais rápido do que moléculas menores, ou seja, quanto menor a molécula, maior o tempo de retenção.

Esta técnica é amplamente utilizada para a determinação do peso molecular de polissacarídeos. SEC é a técnica oficial (sugerida pela farmacopeia europeia) para a comparação do peso molecular de diferentes heparinas de baixo peso molecular disponíveis comercialmente .

Cromatografia de troca iônica

Na cromatografia de troca iônica (IC), a retenção é baseada na atração entre os íons de soluto e os locais carregados ligados à fase estacionária. Os íons solutos da mesma carga que os locais carregados na coluna são excluídos da ligação, enquanto os íons solutos da carga oposta dos locais carregados da coluna são retidos na coluna. Os íons de soluto que são retidos na coluna podem ser eluídos da coluna alterando as condições do solvente ( por exemplo , aumentando o efeito do íon do sistema de solventes aumentando a concentração de sal da solução, aumentando a temperatura da coluna, mudando o pH do solvente , etc.).

Os tipos de trocadores de íons incluem resinas de poliestireno, trocadores de íons de celulose e dextrano (géis) e vidro de poros controlados ou sílica porosa. As resinas de poliestireno permitem ligações cruzadas que aumentam a estabilidade da cadeia. A ligação cruzada mais alta reduz o desvio, o que aumenta o tempo de equilíbrio e, em última análise, melhora a seletividade. Os trocadores de íon de dextrano e celulose possuem tamanhos de poros maiores e baixas densidades de carga, tornando-os adequados para a separação de proteínas

Em geral, os trocadores de íons favorecem a ligação de íons de carga mais alta e raio menor.

Um aumento na concentração do contraíon (em relação aos grupos funcionais nas resinas) reduz o tempo de retenção. Uma diminuição no pH reduz o tempo de retenção na troca catiônica, enquanto um aumento no pH reduz o tempo de retenção na troca aniônica. Ao diminuir o pH do solvente em uma coluna de troca catiônica, por exemplo, mais íons hidrogênio estão disponíveis para competir por posições na fase estacionária aniônica, eluindo assim os cátions fracamente ligados.

Esta forma de cromatografia é amplamente utilizada nas seguintes aplicações: purificação de água, pré-concentração de componentes residuais, cromatografia de troca de ligante, cromatografia de troca iônica de proteínas, cromatografia de troca aniônica de alto pH de carboidratos e oligossacarídeos e outras.

Cromatografia de bioafinidade

Este processo cromatográfico depende da propriedade de substâncias biologicamente ativas para formar complexos estáveis, específicos e reversíveis. A formação desses complexos envolve a participação de forças moleculares comuns, como a interação de Van der Waals , a interação eletrostática, a interação dipolo-dipolo, a interação hidrofóbica e a ligação de hidrogênio. Uma ligação bioespecífica eficiente é formada por uma ação simultânea e combinada de várias dessas forças nos locais de ligação complementares.

Cromatografia aquosa de fase normal

A cromatografia de fase normal aquosa (ANP) é uma técnica cromatográfica que abrange a região da fase móvel entre a cromatografia de fase reversa (RP) e a cromatografia de fase normal orgânica (ONP). Esta técnica é usada para alcançar seletividade única para compostos hidrofílicos, mostrando eluição de fase normal usando solventes de fase reversa.

Eluição isocrática e gradiente

Na Unidade de Pesquisa de Utilização de Produtos Naturais da ARS em Oxford, MS., Um cientista de suporte (r) extrai pigmentos de plantas que serão analisados ​​por um fisiologista de plantas (l) usando um sistema de HPLC.

Uma separação na qual a composição da fase móvel permanece constante ao longo do procedimento é denominada isocrática (significando composição constante ). (No exemplo destes, a porcentagem de metanol ao longo do procedimento permanecerá constante, ou seja, 10%) A palavra foi cunhada por Csaba Horvath que foi um dos pioneiros da HPLC.,

A composição da fase móvel não precisa permanecer constante. Uma separação na qual a composição da fase móvel é alterada durante o processo de separação é descrita como uma eluição gradiente . Um exemplo é um gradiente começando com 10% de metanol e terminando com 90% de metanol após 20 minutos. Os dois componentes da fase móvel são normalmente denominados "A" e "B"; A é o solvente "fraco" que permite que o soluto elua apenas lentamente, enquanto B é o solvente "forte" que elui rapidamente os solutos da coluna. Na cromatografia de fase reversa , o solvente A é frequentemente água ou um tampão aquoso, enquanto B é um solvente orgânico miscível com água, como acetonitrila , metanol, THF ou isopropanol .

Na eluição isocrática, a largura do pico aumenta com o tempo de retenção linearmente de acordo com a equação para N, o número de pratos teóricos. Isso leva à desvantagem de que os picos de eluição tardia se tornam muito planos e amplos. Sua forma e largura podem impedir que sejam reconhecidos como picos.

Um esquema de eluição de gradiente. O aumento da intensidade da fase móvel elui sequencialmente analitos com intensidade de interação variável com a fase estacionária.

A eluição de gradiente diminui a retenção dos componentes de eluição posterior de forma que eles eluem mais rápido, dando picos mais estreitos (e mais altos) para a maioria dos componentes. Isso também melhora a forma do pico para picos com cauda, ​​à medida que o aumento da concentração do eluente orgânico empurra a parte final de um pico para frente. Isso também aumenta a altura do pico (o pico parece "mais nítido"), o que é importante na análise de traços. O programa de gradiente pode incluir aumentos repentinos de "degraus" na porcentagem do componente orgânico, ou declives diferentes em momentos diferentes - tudo de acordo com o desejo de separação ideal em tempo mínimo.

Na eluição isocrática, a seletividade não muda se as dimensões da coluna (comprimento e diâmetro interno) mudam - ou seja, os picos eluem na mesma ordem. Na eluição de gradiente, a ordem de eluição pode mudar conforme as dimensões ou a taxa de fluxo mudam.

A força motriz na cromatografia de fase reversa se origina na ordem superior da estrutura da água. O papel do componente orgânico da fase móvel é reduzir essa ordem elevada e, assim, reduzir a força de retardo do componente aquoso.

Parâmetros

Teórico

As separações de HPLC têm parâmetros teóricos e equações para descrever a separação de componentes em picos de sinal quando detectados por instrumentação, como por um detector de UV ou um espectrômetro de massa. Os parâmetros são amplamente derivados de dois conjuntos de teoria cromatográfica: teoria das placas (como parte da cromatografia de partição ) e a teoria da taxa de cromatografia / equação de Van Deemter . Claro, eles podem ser colocados em prática por meio da análise de cromatogramas de HPLC, embora a teoria da taxa seja considerada a teoria mais precisa.

Eles são análogos ao cálculo do fator de retenção para uma separação por cromatografia em papel , mas descreve quão bem o HPLC separa uma mistura em dois ou mais componentes que são detectados como picos (bandas) em um cromatograma. Os parâmetros de HPLC são: fator de eficiência ( N ), fator de retenção (kappa prime) e fator de separação (alfa). Juntos, os fatores são variáveis ​​em uma equação de resolução, que descreve como os picos de dois componentes se separaram ou se sobrepuseram. Esses parâmetros são usados ​​principalmente para descrever a fase reversa de HPLC e separações de fase normal de HPLC, uma vez que essas separações tendem a ser mais sutis do que outros modos de HPLC ( por exemplo , troca iônica e exclusão de tamanho).

O volume vazio é a quantidade de espaço em uma coluna que é ocupada por solvente. É o espaço dentro da coluna que está fora do material de embalagem interno da coluna. O volume vazio é medido em um cromatograma como o primeiro pico de componente detectado, que geralmente é o solvente que estava presente na mistura da amostra; idealmente, o solvente da amostra flui através da coluna sem interagir com a coluna, mas ainda é detectável como distinto do solvente de HPLC. O volume vazio é usado como um fator de correção.

O fator de eficiência ( N ) mede praticamente o quão nítidos são os picos dos componentes no cromatograma, como proporção da área do pico do componente ("tempo de retenção") em relação à largura dos picos em seu ponto mais largo (na linha de base). Picos altos, agudos e relativamente estreitos indicam que o método de separação removeu com eficiência um componente de uma mistura; alta eficiência. A eficiência depende muito da coluna de HPLC e do método de HPLC usado. O fator de eficiência é sinônimo de número de pratos e o 'número de pratos teóricos'.

O fator de retenção ( kappa prime ) mede por quanto tempo um componente da mistura ficou preso à coluna, medido pela área sob a curva de seu pico em um cromatograma (já que os cromatogramas de HPLC são uma função do tempo). Cada pico do cromatograma terá seu próprio fator de retenção ( por exemplo , kappa 1 para o fator de retenção do primeiro pico). Este fator pode ser corrigido pelo volume vazio da coluna.

O fator de separação ( alfa ) é uma comparação relativa de quão bem dois componentes vizinhos da mistura foram separados ( ou seja , duas bandas vizinhas em um cromatograma). Este fator é definido em termos de uma razão dos fatores de retenção de um par de picos vizinhos do cromatograma e também pode ser corrigido pelo volume vazio da coluna. Quanto maior for o valor do fator de separação acima de 1,0, melhor será a separação, até cerca de 2,0 além do qual um método de HPLC provavelmente não é necessário para a separação. As equações de resolução relacionam os três fatores, de modo que a alta eficiência e os fatores de separação melhoram a resolução dos picos dos componentes em uma separação por HPLC.

Diâmetro interno

Tubulação em um sistema de cromatografia nano-líquida (nano-LC), usado para capacidades de fluxo muito baixas.

O diâmetro interno (ID) de uma coluna de HPLC é um parâmetro importante que influencia a sensibilidade de detecção e seletividade de separação na eluição de gradiente. Também determina a quantidade de analito que pode ser carregada na coluna. Colunas maiores são geralmente vistas em aplicações industriais, como a purificação de um medicamento para uso posterior. As colunas de baixo ID têm sensibilidade aprimorada e menor consumo de solvente em detrimento da capacidade de carga.

Colunas maiores de ID (acima de 10 mm) são usadas para purificar quantidades utilizáveis ​​de material devido à sua grande capacidade de carga.

Colunas em escala analítica (4,6 mm) têm sido o tipo mais comum de colunas, embora colunas menores estejam ganhando popularidade rapidamente. Eles são usados ​​na análise quantitativa tradicional de amostras e geralmente usam um detector de absorvância UV-Vis .

As colunas estreitas (1–2 mm) são usadas para aplicações em que se deseja mais sensibilidade, seja com detectores UV-vis especiais, detecção de fluorescência ou com outros métodos de detecção, como cromatografia líquida-espectrometria de massa

As colunas capilares (abaixo de 0,3 mm) são usadas quase exclusivamente com meios de detecção alternativos, como espectrometria de massa . Eles geralmente são feitos de capilares de sílica fundida , em vez de tubos de aço inoxidável usados ​​por colunas maiores.

Tamanho da partícula

A maioria dos HPLC tradicionais é realizada com a fase estacionária ligada ao exterior de pequenas partículas esféricas de sílica (grânulos muito pequenos). Essas partículas vêm em uma variedade de tamanhos, sendo os grânulos de 5 µm o mais comum. Partículas menores geralmente fornecem mais área de superfície e melhores separações, mas a pressão necessária para a velocidade linear ideal aumenta pelo inverso do quadrado do diâmetro da partícula.

De acordo com as equações da velocidade, eficiência e contrapressão da coluna , reduzir o diâmetro da partícula pela metade e manter o tamanho da coluna igual, dobrará a velocidade e a eficiência da coluna; mas aumenta quatro vezes a contrapressão. E as pequenas partículas de HPLC também podem diminuir o alargamento da largura. Partículas maiores são usadas em HPLC preparativa (diâmetros de coluna de 5 cm até> 30 cm) e para aplicações não-HPLC, como extração em fase sólida .

Tamanho de poro

Muitas fases estacionárias são porosas para fornecer maior área de superfície. Os poros pequenos fornecem uma área de superfície maior, enquanto o tamanho dos poros maiores tem uma cinética melhor, especialmente para analitos maiores. Por exemplo, uma proteína que é apenas ligeiramente menor do que um poro pode entrar no poro, mas não sai facilmente depois de entrar.

Pressão da bomba

As bombas variam em capacidade de pressão, mas seu desempenho é medido em sua capacidade de produzir uma taxa de fluxo volumétrica consistente e reproduzível . A pressão pode atingir 60 MPa (6000  lbf / in 2 ) ou cerca de 600 atmosferas. Os sistemas HPLC modernos foram aprimorados para trabalhar em pressões muito mais altas e, portanto, são capazes de usar tamanhos de partícula muito menores nas colunas (<2 μm). Esses sistemas de "cromatografia líquida de ultra alto desempenho" ou UHPLCs, que também podem ser conhecidos como sistemas de cromatografia de ultra alta pressão, podem trabalhar a até 120 MPa (17.405 lbf / in 2 ), ou cerca de 1200 atmosferas. O termo "UPLC" é uma marca comercial da Waters Corporation , mas às vezes é usado para se referir à técnica mais geral de UHPLC.

Detectores

Os detectores HPLC se enquadram em duas categorias principais: universal ou seletivo. Os detectores universais normalmente medem uma propriedade em massa ( por exemplo , índice de refração ) medindo uma diferença de uma propriedade física entre a fase móvel e a fase móvel com soluto, enquanto os detectores seletivos medem uma propriedade de soluto ( por exemplo , absorvância UV-Vis ) simplesmente respondendo ao propriedade física ou química do soluto. O HPLC mais comumente usa um detector de absorvância UV-Vis ; no entanto, uma ampla variedade de outros detectores de cromatografia pode ser usada. Um detector universal que complementa a detecção de absorvância UV-Vis é o detector de aerossol carregado (CAD). Um tipo de detector comumente utilizado inclui detectores de índice de refração, que fornecem leituras medindo as mudanças no índice de refração do eluente conforme ele se move através da célula de fluxo. Em certos casos, é possível usar vários detectores, por exemplo, LCMS normalmente combina UV-Vis com um espectrômetro de massa.

Amostradores automáticos

Um grande número de amostras pode ser injetado automaticamente em um sistema de HPLC, pelo uso de amostradores automáticos de HPLC. Além disso, os amostradores automáticos de HPLC possuem volume e técnica de injeção exatamente iguais para cada injeção, conseqüentemente proporcionam um alto grau de precisão do volume de injeção. É possível permitir a agitação da amostra dentro da câmara de amostragem, promovendo assim a homogeneidade.

Formulários

Manufatura

HPLC tem muitas aplicações em laboratório e ciência clínica. É uma técnica comum usada no desenvolvimento farmacêutico, pois é uma forma confiável de obter e garantir a pureza do produto. Embora a HPLC possa produzir produtos (puros) de qualidade extremamente alta, nem sempre é o principal método usado na produção de medicamentos a granel. De acordo com a farmacopéia européia, o HPLC é usado em apenas 15,5% das sínteses. No entanto, desempenha um papel em 44% das sínteses na farmacopéia dos Estados Unidos. Isso pode ser devido a diferenças nas restrições monetárias e de tempo, já que HPLC em grande escala pode ser uma técnica cara. Um aumento na especificidade, precisão e exatidão que ocorre com o HPLC, infelizmente, corresponde a um aumento no custo.

Jurídico

Essa técnica também é usada para detecção de drogas ilícitas na urina. O método mais comum de detecção de drogas é um imunoensaio. Este método é muito mais conveniente. No entanto, a conveniência acarreta o custo da especificidade e da cobertura de uma ampla gama de medicamentos. Como HPLC é um método para determinar (e possivelmente aumentar) a pureza, usar HPLC sozinho na avaliação das concentrações de drogas é um tanto insuficiente. Com isso, a HPLC, neste contexto, é frequentemente realizada em conjunto com a espectrometria de massa . O uso de cromatografia líquida em vez de cromatografia gasosa em conjunto com MS contorna a necessidade de derivatizar com agentes de acetilação ou alquilação, o que pode ser uma etapa extra onerosa. Esta técnica tem sido usada para detectar uma variedade de agentes como agentes dopantes, metabólitos de drogas, conjugados de glucuronídeos, anfetaminas, opioides, cocaína, BZDs, cetamina, LSD, cannabis e pesticidas. A realização de HPLC em conjunto com espectrometria de massa reduz a necessidade absoluta de padronizar corridas experimentais de HPLC.

Pesquisar

Ensaios semelhantes podem ser realizados para fins de pesquisa, detectando concentrações de candidatos clínicos em potencial, como medicamentos antifúngicos e para asma. Essa técnica é obviamente útil na observação de várias espécies em amostras coletadas, mas requer o uso de soluções padrão quando se busca informações sobre a identidade das espécies. É utilizado como método para confirmação de resultados de reações de síntese, pois a pureza é essencial neste tipo de pesquisa. No entanto, a espectrometria de massa ainda é a maneira mais confiável de identificar espécies.

Médico

O uso médico de HPLC pode incluir a análise de medicamentos, mas se enquadra mais na categoria de análise de nutrientes. Enquanto a urina é o meio mais comum para analisar as concentrações de drogas, o soro sanguíneo é a amostra coletada para a maioria das análises médicas com HPLC. Outros métodos de detecção de moléculas que são úteis para estudos clínicos foram testados contra HPLC, nomeadamente os imunoensaios. Em um exemplo disso, os ensaios de ligação de proteína competitiva (CPBA) e HPLC foram comparados para sensibilidade na detecção de vitamina D. Útil para diagnosticar deficiências de vitamina D em crianças, verificou-se que a sensibilidade e especificidade deste CPBA atingiu apenas 40% e 60 %, respectivamente, da capacidade de HPLC. Embora seja uma ferramenta cara, a precisão do HPLC é quase incomparável.

Veja também

Referências

Leitura adicional

  • LR Snyder, JJ Kirkland e JW Dolan, Introdução à Cromatografia Líquida Moderna, John Wiley & Sons, Nova York, 2009.
  • MW Dong, HPLC moderno para cientistas praticantes. Wiley, 2006.
  • LR Snyder, JJ Kirkland e JL Glajch, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Sons, New York, 1997.
  • S. Ahuja e HT Rasmussen (ed), HPLC Method Development for Pharmaceuticals, Academic Press, 2007.
  • S. Ahuja e MW Dong (ed), Handbook of Pharmaceutical Analysis por HPLC, Elsevier / Academic Press, 2005.
  • YV Kazakevich e R. LoBrutto (ed.), HPLC for Pharmaceutical Scientists, Wiley, 2007.
  • UD Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997.
  • MC McMaster, HPLC, um guia prático do usuário, Wiley, 2007.

links externos