Coloração de Gram - Gram stain
A coloração de Gram ou coloração de Gram , também chamada de método de Gram , é um método de coloração usado para distinguir e classificar as espécies bacterianas em dois grandes grupos: bactérias gram-positivas e bactérias gram-negativas . O nome vem do bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram , que desenvolveu a técnica.
A coloração de Gram diferencia as bactérias pelas propriedades químicas e físicas de suas paredes celulares . As células Gram-positivas têm uma camada espessa de peptidoglicano na parede celular que retém a coloração primária, violeta de cristal . As células Gram-negativas têm uma camada mais fina de peptidoglicano que permite que o cristal violeta seja removido com a adição de etanol. Eles são manchados de rosa ou vermelho pela contracoloração , geralmente safranina ou fucsina . A solução de iodo de Lugol é sempre adicionada após a adição de violeta de cristal para fortalecer as ligações da mancha com a membrana celular. A coloração de Gram é quase sempre o primeiro passo na identificação preliminar de um organismo bacteriano. Embora a coloração de Gram seja uma ferramenta diagnóstica valiosa em ambientes clínicos e de pesquisa, nem todas as bactérias podem ser classificadas definitivamente por esta técnica. Isso dá origem a grupos gram-variáveis e gram-indeterminados.
História
O método recebeu o nome de seu inventor, o cientista dinamarquês Hans Christian Gram (1853–1938), que desenvolveu a técnica enquanto trabalhava com Carl Friedländer no necrotério do hospital da cidade de Berlim em 1884. Gram planejou sua técnica não com o propósito de distinguir um tipo de bactéria de outro, mas para tornar as bactérias mais visíveis em seções manchadas de tecido pulmonar. Ele publicou seu método em 1884 e incluiu em seu breve relatório a observação de que o bacilo do tifo não retinha a mancha.
Usos
A coloração de Gram é uma técnica laboratorial bacteriológica usada para diferenciar as espécies bacterianas em dois grandes grupos ( gram-positivos e gram-negativos ) com base nas propriedades físicas de suas paredes celulares . A coloração de Gram não é usada para classificar archaea , anteriormente archaeabacteria, uma vez que esses microrganismos produzem respostas amplamente variáveis que não seguem seus grupos filogenéticos .
Alguns organismos são gram-variáveis (o que significa que eles podem manchar tanto negativos quanto positivos); alguns não são corados com nenhum dos corantes usados na técnica de Gram e não são vistos. Em um moderno laboratório de microbiologia ambiental ou molecular, a maior parte da identificação é feita usando sequências genéticas e outras técnicas moleculares, que são muito mais específicas e informativas do que a coloração diferencial.
Médico
As colorações de Gram são realizadas no fluido corporal ou biópsia quando há suspeita de infecção . As manchas de Gram produzem resultados muito mais rapidamente do que a cultura e são especialmente importantes quando a infecção faria uma diferença importante no tratamento e no prognóstico do paciente; exemplos são líquido cefalorraquidiano para meningite e líquido sinovial para artrite séptica .
Mecanismo de coloração
As bactérias Gram-positivas têm uma parede celular semelhante a uma malha espessa feita de peptidoglicano (50-90% do envelope celular) e, como resultado, são manchadas de roxo por violeta de cristal, enquanto as bactérias Gram-negativas têm uma camada mais fina (10% da célula envelope), por isso não retém a mancha roxa e são contra-manchados de rosa pela safranina. Existem quatro etapas básicas da coloração de Gram:
- Aplicação de uma coloração primária ( violeta de cristal ) a um esfregaço fixado por calor de uma cultura bacteriana. A fixação por calor mata algumas bactérias, mas é usada principalmente para fixá-las na lâmina para que não enxáguem durante o procedimento de coloração.
- A adição de iodo , que se liga ao cristal violeta e o aprisiona na célula
- Descoloração rápida com etanol ou acetona
- Contracoloração com safranina . A carbolfucsina às vezes é substituída pela safranina, uma vez que cora mais intensamente as bactérias anaeróbias, mas é menos comumente usada como contracoloração.
| Aplicação de | Reagente | Cor da célula | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Gram-positivo | Gram-negativo | ||||
| Corante primário | violeta de cristal | roxa | roxa | ||
| mordente | iodo | roxa | roxa | ||
| Descolorante | álcool / acetona | roxa | incolor | ||
| Contra-mancha | safranina / fucsina carbol | roxa | rosa ou vermelho | ||
O violeta de cristal (CV) se dissocia em soluções aquosas em CV+
e cloreto ( Cl-
) íons. Esses íons penetram na parede celular de células gram-positivas e gram-negativas. O CV+
O íon interage com componentes carregados negativamente das células bacterianas e mancha as células de roxo.
Iodeto ( I-
ou eu-
3) interage com o CV+
e forma grandes complexos de cristal violeta e iodo (CV-I) dentro das camadas interna e externa da célula. O iodo é frequentemente referido como um mordente , mas é um agente de aprisionamento que impede a remoção do complexo CV-I e, portanto, dá cor à célula.
Quando um descolorante, como álcool ou acetona, é adicionado, ele interage com os lipídios da membrana celular. Uma célula gram-negativa perde sua membrana lipopolissacarídica externa e a camada interna de peptidoglicano fica exposta. Os complexos CV-I são lavados da célula gram-negativa junto com a membrana externa. Em contraste, uma célula Gram-positiva fica desidratada com um tratamento com etanol. Os grandes complexos CV-I ficam presos dentro da célula gram-positiva devido à natureza multicamadas de seu peptidoglicano. A etapa de descoloração é crítica e deve ser cronometrada corretamente; a mancha de violeta cristal é removida das células gram-positivas e negativas se o agente descolorante for deixado por muito tempo (uma questão de segundos).
Após a descoloração, a célula Gram-positiva permanece roxa e a célula Gram-negativa perde sua cor roxa. A contracoloração, que geralmente é safranina carregada positivamente ou fucsina básica, é aplicada por último para dar às bactérias gram-negativas descoloridas uma cor rosa ou vermelha. Tanto as bactérias gram-positivas quanto as gram-negativas pegam a contracoloração. A contracoloração, no entanto, é invisível em bactérias gram-positivas por causa da coloração violeta cristal mais escura.
Exemplos
Bactéria Gram-positiva
As bactérias Gram-positivas geralmente têm uma única membrana ( monoderme ) rodeada por um espesso peptidoglicano. Esta regra é seguida por dois filos: Firmicutes (exceto para as classes Mollicutes e Negativicutes ) e os Actinobacteria . Em contraste, os membros do Chloroflexi (bactérias verdes sem enxofre) são monodermos, mas possuem um peptidoglicano fino ou ausente (classe Dehalococcoidetes ) e podem apresentar coloração negativa, positiva ou indeterminada; membros da Deinococcus-Thermus grupo mancha positiva, mas são diderms com uma espessura de peptidoglicano.
Historicamente , as formas gram-positivas constituíram o filo Firmicutes , um nome agora usado para o maior grupo. Inclui muitos gêneros bem conhecidos, como Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus e Clostridium . Também foi expandido para incluir os molicutes, bactérias como Mycoplasma e Thermoplasma que não têm paredes celulares e, portanto, não podem ser coradas por Gram, mas são derivadas dessas formas.
Algumas bactérias têm paredes celulares que são especialmente adequadas para reter manchas. Eles parecerão positivos pela coloração de Gram, embora não estejam intimamente relacionados a outras bactérias gram-positivas. Elas são chamadas de bactérias ácido-resistentes e só podem ser diferenciadas de outras bactérias gram-positivas por procedimentos especiais de coloração .
Bactéria Gram-negativa
As bactérias Gram-negativas geralmente possuem uma fina camada de peptidoglicano entre duas membranas ( diderme ). O lipopolissacarídeo (LPS) é o antígeno mais abundante na superfície celular da maioria das bactérias Gram-negativas, contribuindo com até 80% da membrana externa de E. coli e Salmonella . A maioria dos filos bacterianos são gram-negativos, incluindo as cianobactérias , bactérias verdes sulfurosas e a maioria das Proteobactérias (com exceção de alguns membros das Rickettsiales e dos insetos endossimbiontes das Enterobacteriales ).
Bactérias Gram-variáveis e Gram-indeterminadas
Algumas bactérias, após a coloração com a coloração de Gram, produzem um padrão variável de Gram: uma mistura de células rosa e roxas é vista. Em culturas de Bacillus, Butyrivibrio e Clostridium , uma diminuição na espessura do peptidoglicano durante o crescimento coincide com um aumento no número de células que se coram como gram-negativas. Além disso, em todas as bactérias coradas com a coloração de Gram, a idade da cultura pode influenciar os resultados da coloração.
As bactérias Gram-indeterminadas não respondem previsivelmente à coloração de Gram e, portanto, não podem ser determinadas como Gram-positivas ou Gram-negativas. Os exemplos incluem muitas espécies de Mycobacterium , incluindo Mycobacterium bovis , Mycobactrium leprae e Mycobacterium tuberculosis , os dois últimos dos quais são os agentes causadores da lepra e da tuberculose, respectivamente. As bactérias do gênero Mycoplasma não têm parede celular em torno de suas membranas celulares , o que significa que não se coram pelo método de Gram e são resistentes aos antibióticos que visam a síntese da parede celular.
Nota ortográfica
O termo coloração de Gram é derivado do sobrenome de Hans Christian Gram ; o epônimo (Gram) é, portanto, maiúsculo, mas não o substantivo comum (mancha), como é usual para termos científicos. As letras iniciais de gram-positivas e gram-negativas , que são adjetivos de mesmo nome , podem ser G maiúsculo ou g minúsculo , dependendo de qual guia de estilo (se houver) rege o documento que está sendo escrito. O estilo em minúsculas é usado pelos Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças e outros regimes de estilo, como o estilo AMA . Os dicionários podem usar letras minúsculas, maiúsculas ou ambas. O uso de Gram-positivos ou Gram-negativos maiúsculos também é comum em muitos artigos e publicações de periódicos científicos . Quando os artigos são submetidos a periódicos, cada periódico pode ou não aplicar o estilo doméstico à versão postprint . As versões de pré-impressão contêm qualquer estilo que o autor tenha usado. Mesmo os regimes de estilo que usam letras minúsculas para os adjetivos gram-positivos e gram-negativos ainda costumam usar letras maiúsculas para a coloração de Gram .