Fluorescência anisotropia - Fluorescence anisotropy

Anisotropia de fluorescência ou polarização de fluorescência é o fenómeno em que a luz emitida por um fluororo tem intensidades desiguais ao longo de diferentes eixos de polarização . Pioneiros no campo incluem Aleksander Jablonski , Gregorio Weber , e Andreas Albrecht. Os princípios da polarização de fluorescência e algumas aplicações do método são apresentados no livro de Lakowicz.

Definição de anisotropia de fluorescência

A anisotropia (R) de uma fonte de luz é definido como a razão entre o componente polarizada para a intensidade total ( ):${\ Displaystyle I_ {T}}$

${\ Displaystyle r = {\ frac {I_ {z} -I_ {y}} {I_ {x} + {y I_} + I_ {z}}}}$

Quando a excitação é polarizada ao longo do eixo z, a emissão do fluoróforo é simétrica em torno do eixo z (Figura). Daí estatisticamente temos . Como , e , temos ${\ Displaystyle I_ {x} = I_ {y}}$${\ Displaystyle I_ {y} = I _ {\ perp}}$${\ Displaystyle I_ {z} = I _ {\ paralelo}}$

${\ Displaystyle r = {\ frac {I _ {\ paralelo} -I _ {\ perp}} {i _ {\ paralelo} + 2I _ {\ perp}}} = {\ frac {I _ {\ paralelo} -I _ {\ perp }}{ISTO}}}}$.

Princípio - o movimento browniano e photoselection

Em fluorescência, uma molécula absorve um fotão e fica animado para um estado de energia mais elevado. Após um pequeno atraso (a média representada como o tempo de vida de fluorescência ), tudo se resume a um estado mais baixo por perder parte da energia como calor e emitindo o resto da energia como outro fóton. A excitação e desexcitação implicam a redistribuição de elétrons sobre a molécula. Assim, a excitação por um fotão pode ocorrer apenas se o campo eléctrico da luz é orientada em um eixo particular sobre a molécula. Além disso, o fotão emitido irá ter uma polarização específico no que diz respeito à molécula. ${\ Displaystyle \ tau}$

O primeiro conceito a entender para medições de anisotropia é o conceito de movimento browniano . Embora a água à temperatura ambiente, contido em um copo para o olho pode parecer muito ainda, ao nível molecular cada molécula de água tem uma energia cinética e, portanto, há uma série contínua de colisões entre as moléculas de água. Uma nanopartícula (ponto amarelo na figura) suspenso em solução será submetido a um passeio aleatório devido à soma destas colisões subjacentes. O tempo de correlação rotacional ( Φ _r ), o tempo que leva para que a molécula rodar um radiano, é dependente da viscosidade ( η ), temperatura (T), constante de Boltzmann ( k _B ) e o volume ( V ) da nanopartícula:

${\ Displaystyle \ phi _ {R} = {{\ eta V} \ k ao longo {{_ {B}}}}} t$

O segundo conceito é photoselection pelo uso de uma luz polarizada. Quando a luz polarizada é aplicada a um grupo de fluoróforos orientadas aleatoriamente, a maioria das moléculas excitadas serão aqueles orientada dentro de uma determinada gama de ângulos em relação à polarização aplicada. Se eles não se movem, a luz emitida também será polarizada dentro de uma determinada gama de ângulos em relação à luz aplicada.

Para a excitação de fotão único a anisotropia intrínseca r ₀ tem um valor teórico máximo de 0,4 quando os dipolos de excitação e emissão são paralelos e um valor mínimo de -0,2 quando os dipolos de excitação e emissão são perpendiculares.

${\ R_ displaystyle {{0}} = {2 \, durante 5} \ esquerda ({{{{3 \ cos} ^ {2}} \ beta -1} \ ao longo de 2} \ direita)}$

onde β é o ângulo entre os dipolos de excitação e emissão. Para medições de fluorescência no estado estacionário que é geralmente medida por incorporação do fluoróforo num congelado poliol .

Tomando o caso mais simples idealista um subconjunto de moléculas de corante em suspensão numa solução que têm um tempo de vida de fluorescência mono-exponencial e r ₀ = 0,4 (6g rodamina no seio de etileno-glicol feito para ter uma absorvância de 0,05 ~ é uma amostra de teste boa). Se a excitação é não polarizada, em seguida, a emissão de fluorescência medida deve ser igualmente não polarizada. Se, contudo, a fonte de excitação é verticalmente polarizado usando um polarizador de excitação, em seguida, a polarização efeitos será apanhado na fluorescência medida. Esses artefatos de polarização pode ser combatido colocando um polarizador de emissão no ângulo mágico de 54.7º. Se o polarizador de emissão é verticalmente polarizado haverá uma perda adicional de fluorescência como resultado o movimento Browniano de moléculas de corante que se deslocam a partir de uma configuração inicial vertical polarizada para uma configuração não polarizada. Por outro lado, se o polarizador de emissão é polarizada horizontalmente, haverá uma introdução adicional de moléculas excitadas que inicialmente foram polarizadas verticalmente e tornou-se despolarizadas via movimento browniano. A soma de fluorescência e a diferença pode ser construído através da adição das intensidades e subtracção das intensidades de fluorescência, respectivamente: ${\ Displaystyle \ tau}$

${\ Displaystyle S = {I_ {VV}} + 2G {I_ {VH}}}$

${\ Displaystyle D = {I_ {VV}} - L {I_ {VH}}}$

Dividindo a diferença pela soma dá a decadência anisotropia:

${\ Displaystyle r = {D \ sobre S}}$

O factor de grade G é uma preferência instrumental da óptica de emissão para a orientação horizontal para a orientação vertical. Pode ser medido, movendo o polarizador de excitação para a orientação horizontal e comparar as intensidades quando o polarizador de emissão é verticalmente e horizontalmente polarizado respectivamente.

${\ Displaystyle L = {{{HH I_}} \ sobre I_ {{HV}}}}$

L é o comprimento de onda de emissão dependente. Nota L na literatura é definida como o inverso mostrado.

O grau de descorrelação na polarização da luz incidente e emitida depende (o tempo de vida de rotação a rapidez com que a orientação do fluoróforo fica mexidos ) em comparação com o tempo de vida de fluorescência ( ). A codificação de orientações pode ocorrer por toda a molécula caindo ou pela rotação de apenas a parte fluorescente. A taxa de caída está relacionada com a anisotropia medido pela equação Perrin: ${\ Displaystyle \ phi}$${\ Displaystyle \ tau}$

${\ Displaystyle r (\ tau) = {\ frac {r_ {0}} {1+ \ tau / \ phi}}}$

Em que r é a anisotropia observada, r ₀ é a anisotropia intrínseca da molécula, é o tempo de vida de fluorescência e é a constante de tempo de rotação.${\ Displaystyle \ tau}$${\ Displaystyle \ phi}$

Esta análise só é válida se os fluoróforos são relativamente distantes. Se eles estão muito perto de um outro, possam trocar de energia por FRET e porque a emissão pode ocorrer a partir de um de muitos mover independentemente (ou orientado) moléculas isto resulta em uma anisotropia mais baixo do que o esperado ou uma maior decorrelação. Este tipo de homotransfer Förster transferência de energia de ressonância é chamado de migração de energia FRET ou emFRET .

O estado estacionário de fluorescência anisotropia só dar uma anisotropia "médio". Muito mais informação pode ser obtida com a anisotropia de fluorescência resolvida no tempo em que o tempo de decaimento, anisotropia residual e tempo de correlação de rotação podem ser determinadas a partir de montagem do decaimento anisotropia. Tipicamente, uma fonte de laser pulsado verticalmente é usado para a excitação e de electrónica de sincronismo são adicionados entre os impulsos de início do laser (início) e a medição dos fotões de fluorescência (paragem). A técnica de tempo de contagem de fotão único Correlacionada (TCSPC) é tipicamente empregue.

Novamente usando o caso mais simples idealista um subconjunto de moléculas de corante em suspensão numa solução que têm um tempo de vida de fluorescência mono-exponencial e uma anisotropia r inicial ₀ = 0,4. Se a amostra está animado com uma fonte de excitação verticalmente orientada pulsava em seguida, um único tempo de decaimento deve ser medido quando o polarizador de emissão é no ângulo mágico. Se o polarizador de emissão é verticalmente polarizado, em vez de dois tempos de decaimento será medido tanto com factores pré-exponencial positivos, o primeiro tempo de decaimento deve ser equivalente a medida com a emissão não polarizada definir-se e o segundo tempo de decaimento vai ser devido à perda de fluorescência como resultado o movimento browniano de moléculas de corante que se deslocam a partir de uma configuração inicial vertical polarizada para uma configuração não polarizada. Por outro lado, se o polarizador de emissão é polarizada horizontalmente, duas vezes deterioração irá novamente ser recuperado o primeiro um com um factor de pré-exponencial positiva e será equivalente a , mas a segunda terá um factor de pré-exponencial negativo resultante da introdução de moléculas excitadas que inicialmente foram polarizadas verticalmente e tornou-se despolarizadas via movimento browniano. A soma de fluorescência e a diferença pode ser construída através da adição dos decaimentos e subtracção da fluorescência decai respectivamente: ${\ Displaystyle \ tau}$${\ Displaystyle \ tau}$${\ Displaystyle \ tau}$${\ Displaystyle \ tau}$

${\ Displaystyle S (t) = L {I_ {VV}} (t) 2 {{VH I_}} (t)}$

${\ Displaystyle D (t) = L {I_ {VV}} (t) - {{VH I_}} (t)}$

Dividindo a diferença pela soma dá a decadência anisotropia:

${\ Displaystyle r (t) = {D (t) \ ao longo do S (t)}}$

No caso mais simples para apenas uma espécie de corante esférica:

${\ Displaystyle r (t) = {r_ {0}} \ exp \ left ({- {t \ over {\ phi _ {r}}}} \ right)}$

aplicações

Anisotropia de fluorescência pode ser utilizado para medir as constantes de ligação e da cinética das reacções que causam uma mudança no tempo de rotação das moléculas. Se o fluoróforo é uma molécula pequena, a taxa à qual ele cai pode diminuir significativamente quando ele está ligado a uma proteína grande. Se o fluoróforo está ligado à proteína maior em um par de ligao, a diferença de polarização entre estados ligados e não ligados será menor (porque a proteína não ligada já será bastante estável e secar lentamente para começar) e a medição será menos precisos . O grau de ligação é calculado usando a diferença na anisotropia do (excesso grande de proteína) parcialmente ligada, livre e totalmente estados ligados medido por titulação os dois parceiros de ligação.

Se o fluoróforo é ligado a uma molécula relativamente grande como uma proteína ou um RNA, a mudança na mobilidade de dobragem que acompanha podem ser usadas para estudar a dinâmica de dobragem. Isto proporciona uma medida da dinâmica de como a proteína atinge a sua, forma 3D estável final.

anisotropia de fluorescência também é aplicada a microscopia, com uso de polarizadores no caminho da luz que ilumina e também diante da câmera. Isto pode ser utilizado para estudar a viscosidade local do citosol ou membranas, com este último que dá informação sobre a microestrutura da membrana e as concentrações relativas dos diversos lípidos. Esta técnica também foi usada para detectar a ligação de moléculas aos seus parceiros em cascatas de sinalização em resposta a certos estímulos.

O fenómeno de emFRET e a redução associada em anisotropia quando interacções próximas ocorrer entre fluororos tem sido utilizada para estudar a agregação de proteínas em resposta à sinalização.

Veja também

• factores de fricção Perrin
• transferência de FRET e energia BRET

Referências